Denne studien detaljer prosessen med gavaging nøyaktig mengder probiotika til neonatal mus. Den eksperimentelle set-up var optimalisert for å inkludere, men er ikke begrenset til probiotiske dosering, metoder for administrasjonen og kvantifisering av bakterier i tarmen.
Voksen musen modeller har vært mye brukt å forstå mekanismen bak sykdomsprogresjon hos mennesker. Anvendelse av studier gjort i voksen mus modeller neonatal sykdommer er begrenset. For bedre å forstå sykdomsprogresjon, vert svar og langsiktig effekt av nyfødte, er en neonatal musemodell sannsynlig en bedre passform. Sparsom bruk av neonatal musen modeller kan delvis tilskrives de tekniske vanskelighetene med å jobbe med disse små dyr. En neonatal musemodell ble utviklet å bestemme effekten av probiotiske administrasjon i tidlige liv og spesielt vurdere muligheten til å opprette kolonisering i nyfødte musen tarmkanalen. Spesielt for å vurdere probiotiske kolonisering neonatal musen, ble Lactobacillus plantarum (LP) levert direkte til neonatal musen mage-tarmkanalen. Dette ble LP administrert til mus av fôring gjennom intra-spiserøret (IE) gavage. En svært reproduserbar metode ble utviklet for å standardisere prosessen med IE gavage som gir en nøyaktig administrasjon av probiotiske doser samtidig minimere traumer, en del spesielt viktig gitt gebrekkelighet av nyfødte mus. Begrensninger av denne prosessen omfatter muligheter esophageal irritasjon eller skade og aspirasjon hvis gavaged feil. Dette representerer en forbedring på gjeldende praksis fordi IE gavage i distale spiserøret reduserer sjansene av aspirasjon. Etter gavage, kolonisering profilen probiotiske ble sporet med kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) av utdraget intestinal DNA LP bestemt primere. Ulike søppel innstillinger og bur teknikker ble brukt til å vurdere mulighetene for kolonisering oppslag. Protokollen detaljer vanskelighetene med IE neonatal mus gavage og påfølgende koloniseringen kvantifisering LP.
Hos spedbarn, har tidlig probiotiske eksponering blitt assosiert med immunmodulerende virkninger fører til redusert forekomst av sykdommer som nekrotiserende enterokolitt, atopisk dermatitt og sepsis1,2,3, 4 , 5. men mekanismen bak dette immunmodulerende svaret er utfordrende for å utforske gitt begrensningen til prøvetaking i nyfødte menneskelige studier (dvs. sekvensiell blod uavgjorte og biopsier). Neonatal musen modeller kan hjelpe studere virkningsmekanismen involvert i neonatal immun regulering forbundet med probiotiske bruk og endringer i tarmen bakterieflora. Dessverre, de fleste musen modeller for Probiotika har i stor grad fokusert på voksen mus; men er effekten av probiotika sannsynlig å være høyeste tidlig i livet, foreslå modeller som er spesifikke for denne aldersgruppen vil være nyttig3,6. I tillegg er neonatal musen modeller bedre egnet til å studere sykdommer og intervensjoner ment for programmet i tidlig liv menneskelige spedbarn som de forventes å nærmere etterligner en utvikler immunsystemet og mikrobiell7,8 ,9,10. Målet var å studere omfanget av og mønstrene av probiotiske kolonisering av neonatal mus med fokus på mekanistisk samspillet mellom verten og dens microbiome. Egnet beskrivelser av nyfødte modeller ble ikke funnet i litteraturen, og dermed behov for utvikling av robuste og standardisert metode var adressert.
Etablerte metoder av peroral administrering av ulike forbindelser til nyfødte mus inkluderer mors overføring av ønsket forbindelser gjennom melk ved behandling av vannkilde for gravide damer11 eller fôring nåler for å lette administrasjonen av ønsket forbindelser i oropharynx12. Disse metodene er nyttig for eksperimenter som ikke har presis dosering krav og hvor behandling er lett ingested av mottakeren musen. Probiotika administreres ofte sammen med prebiotiske som galactooligosaccharide og fructooligosaccharide (FOS) som fungerer som en kilde til næring for probiotiske bakterier; forbindelsene additiv gjøre løsningen tyktflytende og utfordrende å administrere via de ovennevnte metodikkene. Utarbeide en metode for presis mengder probiotika og prebiotics å nyfødte mus så tidlig som første dag av livet (DOL) var nødvendig. Holder på å utvikle gavage teknikken, muligheten for kolonisering oppslag (som observert i andre probiotiske studier mellom behandling og kontroll armene13,14,15,16) ble testet og den relative overfloden av koloniserte Lactobacillus plantarum (LP) i tarmen av pups med forskjellige gavage tidsplaner ble vurdert. Probiotiske utarbeidelse brukes i forsøkene besto av 109 colony-forming enheter (CFU) per gavage av LP (ATCC-202195 belastning), blandet med FOS (prebiotiske) og maltodekstrin (hjelpestoff) som beskrevet i den siste menneskelige prøve3. Probiotiske leveringen var dyktig bruker IE gavage og prosessen er beskrevet i protokollen nedenfor. Kolonisering profilen probiotiske ble evaluert benytter sanntid utvidelse av DNA utvunnet fra hele tarmen med LP bestemt primere.
Prosedyren for IE gavage ble utviklet å trygt administrere en bestemt dose av en probiotiske neonatal mus. Små mengder av væske leveres til øvre gastrointestinal skrift bruker en fôring nål for å hindre aspirasjon samtidig sikre levering av dosering i tillit. Tarmen av mus ble samlet inn for kolonisering analyse to og seks dager legge gavage. Prosedyren for DNA utvinning ble endret for å sikre høy avkastning av probiotiske Gram-positive organismen. QPCR analyse av DNA utdraget to dager innlegg siste gavage viste relativt høyere kolonisering av LP i mus gavaged hver to dager i forhold til mus gavaged hver dag mellom DOL 2-8. Det var også en nedgang i LP over seks dager, viser denne probiotiske å være en forbigående organisme i tarmen av musen. Resultatene av disse eksperimentene etablere betingelsene for å forske med høy fasthet i denne aldersgruppen.
For å observere de langsiktige effektene av probiotika i neonatal mus, ble det administrert til neonatal mus på DOL 2; en lignende starttidspunktet pek menneskelige rettssaken. Orofaryngeal fôring neonatal mus er beskrevet tidligere i litteratur og er utført etter DOL 5-812,17 når risikoen for aspirasjon er lavere på grunn av en godt utviklet svelge mekanikk. Men er orofaryngeal mate ikke godt egnet for DOL 2 mus som høyere priser av aspirasjon ble observert i pilotstudien (data ikke vist). Tyktflytende slags probiotiske og prebiotiske løsning lagt til risikoen for aspirasjon. Fremgangsmåten IE gavaging minimert risikoen for aspirasjon i DOL 2 mus mens levere ønsket volum direkte til øvre gastrointestinal skrift. Suksessen til prosedyren ble først bekreftet bruker konditorfarge infundert probiotiske gavage. Konditorfarge fungerer som en markør som vises gjennom huden av valp. Ingen negative effekter ble observert i mus gavaged med konditorfarge, og det anbefales å validere gavaging prosedyren på denne måten før du setter store eksperimenter. Rask løsning på de gisper reflex sett innlegg gavage kan også brukes som en ytterligere indikator for en vellykket gavage. Når musen er plassert på den varme teppet etter gavage, det gisper refleks vil avta og en økning i puste frekvensen vil bli observert innen 20 sekunder. Videreføring av den gisper refleks i mer enn 30 sekunder indikerer en mislykket gavage. Vellykket gavage avhenger også riktig innsetting av fôring nålen med pære sitter rett over åpningen av cardiac sphincter av magen. Dette kan ordnes ved å sikre at merkingen på pinne måle lengden mellom xiphoid prosessen og spissen av snuten, ikke gå forbi snuten av musen under gavage. Dette minimerer sjansen for skade på musen. Frekvensen for gavage kan ha en betydelig innvirkning på de eksperimentelle resultatene. Hyppige gavaging kan også opprette mer stress for valpene og mor på grunn av konstant forstyrrelsene buret og reiret. Den mest optimale gavage planen er når gavages er den minste hyppige og over en kortere varighet av tid uten å miste den forventede effekten i systemet. For å sikre sikkerhet og sterilitet prosedyren gavage må p steriliseres ved vask og autoklavering mellom bruk. Vask grundig på utenfor hjelp en skrubb og innsiden av presser vann gjennom nålen bruker en sprøyte før autoklavering er nødvendig som noen leftover partikler kan encrust på p under autoklavering kan forstyrre gavaging prosedyren.
Høyere LP kolonisering ble observert i pups det var gavaged annenhver dag sammenlignet pups gavaged hver dag. Dette kan skyldes redusert stress på pups gavaged annenhver dag og potensielt probiotiske får mer næringsstoffer gjennom relativt mer melk ingested av disse valpene. Dose avhengighet av probiotiske behandlingen har vært tidligere studert i musen modeller18,19 og dermed av riktig dosering er viktig. Probiotiske løsningen forberedt er belagt før alle gavage å få et nøyaktig antall CFU administrert. Hvis probiotiske organismen er anaerob, er det viktig å se hvis det er forskjell i CFU når kultivert din aerobt eller anaerob. Siden LP er en facultative anaerobe, det ble kultivert med både metoder og ingen forskjell i CFU ble observert.
Innlegg gavage intestinal LP Last analysen ble gjort ved hjelp av qPCR og høy kvalitet DNA-prøver. For å minimere LP DNA forurensning mellom behandling og kontroll grupper, ulike fôring nåler, biosafety skap og kirurgisk utstyr ble brukt for å sikre høyest kvalitet prøver. Nøyaktig måling av probiotiske i tarmen nødvendig en optimalisert DNA utvinning metoden. Mest effektive metoder for utvinning av DNA fra avføring innebærer flere perle slo trinnene20,21,22. Denne metoden var adoptert for utvinning av tarmbakterier bruker perle juling og observert redusert representasjon (< 102 Kopier gjenopprettet) av LP i hele tarmen DNA utvinning. LP er en Gram positiv organisme med en betydelig mengde Peptidoglykan i celleveggen, var protokollen optimalisert med en Peptidoglykan oppløsning trinn bruker lysozyme23,24 lagt til enzymatisk lyseringsbuffer. Dette økt representasjon av LP i samme intestinal utvalget av større enn to ganger. Lysozyme behandling sikrer oppløsningen av det ytterste laget mens perlen slo trinn forenkler lysis av organismen. Optimalisering av mengden vev, av garnet perle og varigheten av avbrudd med perler er nødvendig for å oppnå optimal DNA produkter å gjennomføre PCR analysen.
Den positive virkningen av probiotika administrert som profylakse eller behandling i pre-term og sikt nyfødte er dokumentert i nyere studier25,26,27,28. Etablering av en skikkelig neonatal musemodell for Probiotika er garantert for å pakke beskyttende effekten av probiotika. Denne protokollen skissert her representerer en støttelinje for forskere ukjent neonatal musen arbeidet med probiotika. Til tross for problemene med gnager bakterieflora mens han studerte helse og sykdom, kan denne metoden utvides til forskning fokusert på å forstå endringene av microbiome på grunn av probiotika. Denne modellen gir også en plattform for å studere vert-mikrobe samhandling og immunreaksjoner i løpet av ulike utviklingsstadier.
The authors have nothing to disclose.
Takk til dyr omsorg anlegget ansatte og UBC veterinærer for opplæring og bistå i musen fungerer ved BC Children’s Hospital Research Institute. Takk til University of British Columbia og Institutt for eksperimentell medisin for finansiering studien.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |