Bedömning av ultrastrukturella neuroplasticitet parametrar efter i Utero transduktion i utvecklingsländer mus hjärnan och ryggmärgen
Summary
Kombinationen av transmissionselektronmikroskopi och i livmodern transduktion är en kraftfull metod för att studera morfologiska förändringar i den fina ultrastruktur nervsystemet under utveckling. Denna kombinerade metod kan djupa insikter i förändringar i strukturella Detaljer underliggande neuroplasticitet med avseende på deras topografiska representation.
Abstract
Föreliggande studie kombinerar i livmodern transduktion med transmissionselektronmikroskopi (TEM) som syftar till en noggrann morphometrical analys av ultrastrukturella parametrar i entydigt identifierade topografiska strukturer, påverkas av ett protein av intresse som införs i organismen via viral överföring. Detta kombinerat tillvägagångssätt möjliggör en smidig övergång från makrostrukturella till ultrastrukturella identifiering av följande topografisk navigationskartor i en vävnad atlas. Högupplösande elektronmikroskopi av i-utero-sensorik vävnad avslöjar den fina ultrastruktur av neuropil och dess plasticitet parametrar, exempelvis över uppställd synaptic bouton utrymmen, antalet synaptiska vesikler och mitokondrier inom en Bouton profil, längden av synaptiska kontakter, över uppställd axonal områden, tjockleken på myelin slidor, antalet myelin lamellerna och över uppställd områden av mitokondrier profiler. Analysen av dessa parametrar avslöjar viktiga insikter om ändringar av ultrastrukturella plasticitet i de delar av nervsystemet som påverkas av viral överföring av den genetiska konstruktionen. Denna kombinerade metod kan inte bara användas för att studera den direkta effekten av genetiskt modifierade biomolekyler och/eller droger på neuronal plasticitet men öppnar också möjligheten att studera i livmodern räddningsaktionen av neuronal plasticitet (t.ex. i samband med neurodegenerativa sjukdomar).
Introduction
Ingen fotonen kan penetrera en ultrathin vävnad förlagan i djup betyget av en elektron. Detta attribut ovärderliga fördelar till TEM fånga nanometers upplösning bilder av fina strukturer jämfört med ljusmikroskopi tekniker. TEM kan exempelvis för visualisering av intracellulära organeller som mitokondrier, melanosomer och olika typer av sekretoriska granuler, Mikrotubuli, microfilaments, cilier, Mikrovilli och intercellulära junctions (cellytan inriktningar), i synnerhet synapser i nervsystemet1,2,3,4. Det övergripande målet för den aktuella metodologiska studien är ultrastrukturella erkännande av förändringar i neural plasticitet under utveckling vid prenatal störningar genom att kombinera state-of-the-art tekniker för i livmodern transduktion och TEM. Viralt kodade proteiner av intresse har varit sensorik i livmodern in centrala nervsystemet5,6,7, inklusive ryggmärgen6. Exempelvis har i livmodern transduktion i kombination med TEM använts för att studera effekten av cell adhesion molekylen L1 på motor lärande plasticitet i L1-brist möss, i synnerhet när det gäller samspelet mellan L1 och nukleär receptor proteiner i lillhjärnan nervceller7.
Analysen av neuroplasticity parametrar kräver exakt information om lokaliseringen av de minsta områdena inom nervsystemet. Därför är det lämpligt att beskriva ultrastrukturella detaljer och deras exakta topografiska orientering med avseende på andra strukturer. I den aktuella studien presenteras en viss förberedande metod syftar till detaljerad utredning av distinkta morfologiska områden utifrån både ljus- och elektronmikroskopi. Denna strategi kombinerar flera tekniker av vävnad manipulation, börjar med i livmodern transduktion i mus hjärnan och ryggmärgen och följt av perfusion fixering, mögel-inbäddning och bearbetning vävnaden för TEM. Ett viktigt steg som ingår mellan för inbäddning och bearbetningen av vävnad för TEM är dokumentation av vävnad, med hjälp av störningar ljusreflektion teknik som möjliggör exakt microphotographic och låg förstoring dokumentationen av vävnaden exemplar8,9,10. Införlivas med den nuvarande metoden, möjliggör denna teknik forskare att undersöka topografiska och strukturella Detaljer av nervvävnad ytor och preparatet slice profiler innan deras förberedelse för TEM.
En särskild ram för snittning hela hjärnor motsvarar stereotaxic koordinater. Denna ram gynnar morfologiska tredimensionella (3D) återuppbyggnaden av områden i nervvävnad och kan användas för morfometriska analys. Macrographs visualiserade avsnitt tilldelas topografiska koordinater, och avsnitten seriellt numrerade bygga kartor i en vävnad atlas.
Efter harts bearbetning, inbäddade vävnaden är sektioneras i ultrathin sektioner (< 70 nm) som innehåller utvalda områden, enligt kartor över ovannämnda vävnad atlas. Avsnitten ultrathin utsätts för TEM att få högupplösta bilder av plasticitet parametrar (t.ex. tvärsnitt profilområden av synaptic knappar eller axonal fibrer) av deras innehåll och kontakter till närliggande strukturer inom anläggningen neuropil.
Med den metod som beskrivs häri, möjliggör en smidig övergång från visualiserade macrostructures till mikro- och nanostrukturer jämförande fördjupade studier av morfologiska neuronal plasticitet efter Utero transduktion av framkallningen nervös systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett avgörande steg för i livmodern transduktion är Injektionsproceduren. Den exakta injektionen i hjärnans ventriklar eller till ett annat område av intresse kräver erfarenhet och praktisk färdighet. Ju tunnare microcapillary spets, den mindre vävnadsskadan kan förekomma; Detta är dock på bekostnad av ökande insprutningstryck. I motsats till i livmodern elektroporation19,20,21,22, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar kollegorna i djuranläggningen vid den medicinska fakulteten, Ruhr-University Bochum, för deras stöd och djur vård.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
