SAE-CRISPR est une technologie puissante à l’ingénieur les génomes complexes de plantes et d’animaux. Ici, nous détaillons un protocole pour modifier efficacement le génome humain endonucléases de Cas différents. Nous mettons en évidence les considérations importantes et des paramètres de conception pour optimiser l’efficacité édition.
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Article de méthode
Modification du génome dans des lignées de cellules mammifères à l’aide de CRISPR-Cas
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le système régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster fonctionne naturellement dans l’immunité adaptative bactérienne, mais a été réorienté avec succès pour le génie du génome chez de nombreux organismes de vie différents. Le plus souvent, le type sauvage CRISPR associés 9 (Cas9) ou endonucléase de Cas12a est utilisé en conjonction avec des sites spécifiques dans le génome, après quoi la rupture d’ADN double brin est réparée par l’intermédiaire de la fin non homologue, rejoindre la voie (NHEJ) ou le (réparation axés sur l’homologie Voie HDR) selon si un modèle de donneur est absent ou présentent respectivement. A ce jour, systèmes CRISPR provenant de différentes espèces bactériennes ont démontré être capable d’effectuer le montage de génome dans les cellules de mammifères. Toutefois, malgré l’apparente simplicité de la technologie, plusieurs paramètres de conception doivent être prises en considération qui laissent souvent perplexes sur la façon de mieux pour réaliser leur génome édition expériences les utilisateurs. Nous décrivons ici un workflow complet de conception expérimentale à l’identification des clones de cellules qui transportent les adaptations ADN désirées, dans le but de faciliter l’exécution réussie du génome édition des expériences dans des lignées cellulaires de mammifères. Nous mettons en évidence les considérations clés pour les utilisateurs de prendre note du, y compris le choix du système CRISPR, la longueur de l’entretoise et la conception d’un modèle de donateurs monocaténaire ODN (ssODN). Nous prévoyons que ce flux de travail vous sera utile pour les études de gènes knockout, modélisation des efforts, la maladie ou la génération de reporter des lignées cellulaires.
Introduction
La capacité à l’ingénieur le génome de tout organisme vivant a beaucoup d’applications biomédicales et biotechnologiques, telles que la correction des pathogènes mutations, construction de modèles cellulaires précis pour les études de la maladie, ou génération d’agricoles cultures avec traits désirables. Depuis le tournant du siècle, plusieurs technologies ont été développées pour le génie du génome dans les cellules de mammifères, y compris les méganucléases1,2,3, zinc finger nucleases4,5, ou transcription activator ....
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Protocole
1. conception de sgRNAs
- Sélectionnez un système CRISPR-Cas approprié.
- Tout d’abord, examinez la région cible pour les séquences de PAM de tous les nucléases Cas9 et Cas12a qui sont sont révélées être fonctionnel dans les cellules de mammifères16,21-32. Cinq enzymes fréquemment utilisés sont donnés dans le tableau 1 ainsi que de leurs respectifs PAMs.
Remarque : outre les endonucléases énumérés au tableau 1, il existe d’autres enzymes Cas moins fréquemment utilisés qui ont été déployées avec succès dans les cellules de mammifères, tels qu’une nucléase Cas9 de Streptococcus thermophilus (St1Cas9)....
- Tout d’abord, examinez la région cible pour les séquences de PAM de tous les nucléases Cas9 et Cas12a qui sont sont révélées être fonctionnel dans les cellules de mammifères16,21-32. Cinq enzymes fréquemment utilisés sont donnés dans le tableau 1 ainsi que de leurs respectifs PAMs.
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Résultats
Pour effectuer un génome édition experiment, un plasmide CRISPR exprimant un sgRNA ciblant que le locus d’intérêt doit être cloné. Tout d’abord, le plasmide est digéré par une enzyme de restriction (généralement de type IIs enzyme) de linéariser il. Il est recommandé de régler le produit digéré sur un gel d’agarose de 1 % aux côtés d’un plasmide non digéré de distinguer une digestion complète ou partielle. Comme les plasmides non digérés sont surenroulés, ils ont tendance à courir plus vite que leurs homologues linéarisé.......
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Discussion
Le système CRISPR-Cas est une puissante technologie révolutionnaire à l’ingénieur les génomes et les transcriptions des plantes et des animaux. De nombreuses espèces bactériennes ont été trouvés pour contenir les systèmes CRISPR-Cas, qui peuvent éventuellement être adaptées pour le génome et transcriptome fins44d’ingénierie. Bien que l’endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) a été la première enzyme qui seront déployés avec succès dans les cellules humaines2.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas de concurrence des intérêts financiers.
Remerciements
M.H.T. est pris en charge par un organisme de délivrance de bureau conseil commun Science Technology and Research (1431AFG103), un Conseil National de la recherche médicale accorde (OFIRG/0017/2016), accorde à la National Research Foundation (NRF2013-THE001-046 et NRF2013-THE001-093), un Subvention du ministère de l’éducation niveau 1 (RG50/17 (S)), une startup subvention de Nanyang Technological University et les fonds pour le concours International génétiquement ingénierie Machine (iGEM) de Nanyang Technological University.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| T4 Polynucléotide kinase (PNK) | NEB | M0201 | |
| Crevette Phosphatase alcaline (rSAP) | NEB | M0371 | |
| Tris-Acétate-EDTA (TAE) Tampon, 50X | 1ère Base | BUF-3000-50X4L | Diluer à 1X avant utilisation. La solution 1X contient 40 mM de Tris, 20 mM d’acide acétique et 1 mM d’EDTA. |
| Tampon Tris-EDTA (TE), 10X | 1ère Base | BUF-3020-10X4L | Diluer à 1X avant utilisation. La solution 1X contient 10 mM de Tris (pH 8,0) et 1 mM d’EDTA. |
| BbsI | NEB | R0539 | |
| BsmBI | NEB | R0580 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400 000 unités/ml |
| Kit de ligature rapide | NEB | M2200 | Une alternative à l’ADN ligase T4. |
| Kit de ligature rapide de l’ADN | Thermo Scientific | K1423 | Une alternative à l’ADN ligase T4. |
| Kit de clonage TOPO PCR Zero Blunt | Thermo Scientific | 451245 | La solution saline est livrée avec le vecteur TOPO dans le kit. |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit pour montage Gibson. |
| One Shot Stbl3 Chimiquement compétent E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
| LB Bouillon (Lennox), poudre | Sigma Aldrich | L3022 | Reconstituer en ddH20, et autoclave avant utilisation |
| LB Bouillon avec gélose (Lennox), poudre | Sigma Aldrich | L2897 | Reconstituer en ddH20, et autoclave avant utilisation |
| du milieu SOC | - | - | 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 20 mM de glucose dans 1 L de bouillon LB |
| Ampicilline (sodium), USP Grade | Gold Biotechnology | A-301 | |
| REDiant 2X PCR Mastermix | 1ère Base | BIO-5185 | |
| Agarose | 1ère Base | BIO-1000 | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | |
| Extraction d’ADN plasmidique Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), Hyclone à haute teneur en glucose | SH30081.01 | 4,5 g/L de glucose, sans L-glutamine, HEPES et pyruvate de sodium | |
| L-glutamine, 200 | mM Gibco | 25030 | |
| Pénicilline-streptomycine, 10, 000U/mL | Gibco | 15140 | |
| 0,25 % trypsine-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
| Fœtus bovin Le sérum | Hyclone | SV30160 | FBS est inactivé thermiquement avant utilisation à 56 oC pendant 30 minutes |
| Solution saline tamponnée au phosphate, 1X | Gibco | 20012 | |
| jetPRIME réactif de transfection | Polyplus Transfection | 114-75 | |
| Solution d’extraction d’ADN QuickExtract, 1.0 | Epicentre | LUCG-QE09050 | |
| ISOLATE II Kit d’ADN génomique | Bioline | BIO-52067 | Une alternative à QuickExtract |
| Q5 ADN polymérase haute fidélité | NEB | M0491 | |
| Désoxynucléotide (dNTP) Mélange de solution | NEB | N0447 | |
| 6X Colorant de chargement d’ADN | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03 % de bleu de bromophénol, 0,03 % de cyanol de xylène FF, 60 % de glycérol, 60 mM d’EDTA |
| Cocktail d’inhibiteur de protéase, Set3 | Merck | ||
| Membrane nitrocellulosique, 0,2µ ; m | Bio-Rad | 1620112 | |
| Tris-glycine-SDS tampon, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Diluer à 1X avant utilisation. La solution 1x contient 25 mM de Tris, 192 mM de glycine et 0,1 % de SDS. |
| Tampon tris-glycine, 10X | 1ère base | BUF-2020 | Diluer à 1X avant utilisation. La solution 1x contient 25 mM de Tris et 192 mM de glycine. |
| Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
| TBS, 20X | 1ère base | BUF-3030 | Diluer à 1X avant utilisation. La solution 1x contient 25 mM de Tris-HCl (pH 7,5) et 150 mM de NaCl. |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Lait écrémé pour immunodosage | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
| WesternBright Sirius-femtogramme HRP | Advansta | K12043 | |
| Anticorps pour &bêta ;-actine (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Numéro de lot : C0916 |
| Système MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Fluorimètre Qubit | Thermo Scientific | Q33226 | |
| EVOS FL Système d’imagerie cellulaire | Thermo Scientific | AMF4300 | |
| plasmide CRISPR : pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Système à vecteur unique : L’ARNg est exprimé à partir du même plasmide. |
| Plasmide CRISPR : pX601-AAV-CMV ::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Système à vecteur unique : L’ARNg est exprimé à partir du même plasmide. |
| Plasmide CRISPR : xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Système à double vecteur : L’ARNg est exprimé à partir d’un plasmide différent. |
| Plasmide CRISPR : pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Système à vecteur unique : L’ARNg est exprimé à partir du même plasmide. |
| Plasmide CRISPR : hCas9 | Addgene | 41815 | Système à double vecteur : L’ARNg est exprimé à partir d’un plasmide différent. |
| Plasmide CRISPR : eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | Système à vecteur unique : L’ARNg est exprimé à partir du même plasmide. |
| Plasmide CRISPR : VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | Système à double vecteur : L’ARNg est exprimé à partir d’un plasmide différent. |
Références
- Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
- Arnould, S., et al.
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Réimpressions et autorisations
