Approcci comportamentali allo studio dello stress innato nel zebrafish
Summary
Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare la sollecitazione comportamentale in un pesce zebra adulto. L’approccio sfrutta la tendenza innata che il pesce zebra preferisce la metà inferiore di un serbatoio quando è in uno stato stressante. Descriviamo anche i metodi per accoppiare il saggio con la farmacologia.
Abstract
Rispondere in modo appropriato agli stimoli stressanti è essenziale per la sopravvivenza di un organismo. Una vasta ricerca è stata fatta su un ampio spettro di malattie legate allo stress e disturbi psichiatrici, eppure ulteriori studi sulla regolazione genetica e neuronale dello stress sono ancora necessari per sviluppare terapie migliori. Il pesce zebra fornisce un potente modello genetico per indagare le basi neurali dello stress, in quanto esiste una vasta collezione di linee mutanti e transgeniche. Inoltre, la farmacologia può essere facilmente applicata al pesce zebra, poiché la maggior parte dei farmaci può essere aggiunta direttamente all’acqua. Descriviamo qui l’uso del ‘ romanzo Tank test ‘ come metodo per studiare le risposte di stress innata nel pesce zebra e dimostrare come i potenziali farmaci ansiolitici possono essere convalidati utilizzando il saggio. Il metodo può essere facilmente accoppiato con linee pesce zebra che ospitano mutazioni genetiche, o quelle in cui vengono utilizzati approcci transgenici per manipolare precisi circuiti neurali. Il saggio può essere utilizzato anche in altri modelli di pesce. Insieme, il protocollo descritto dovrebbe facilitare l’adozione di questo semplice saggio ad altri laboratori.
Introduction
Le risposte allo stress sono alterate comportamentali e gli stati fisiologici risultanti da stimoli potenzialmente dannosi o avsivi. Le risposte allo stress sono conservate in tutto il Regno animale e sono fondamentali per la sopravvivenza di un organismo1. Decenni di ricerca hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza di alcuni dei meccanismi genetici e neuronali alla base degli Stati di stress. Oggi, aree del cervello come l’amigdala e lo striato2, e fattori genetici come l’ ormone rilasciante corticotropina (CRH), e i recettori glucocorticoidi (gr) e mineralocorticoidi ( Mr) sono stati studiati ampiamente3,4,5,6. Nonostante questi risultati critici, molto rimane sconosciuto sulla regolazione genetica e neuronale dello stress. Come tale, molti disturbi legati allo stress soffrono di una mancanza di terapie.
Organismi modello geneticamente emendabili forniscono uno strumento utile nello studio del controllo genetico e neuronale del comportamento. I modelli di pesce, in particolare, sono estremamente potenti: sono piccoli organismi con tempi di breve generazione, il loro uso in un ambiente di laboratorio è facile, i loro geniti sono facilmente modificati e, come un vertebrato, condividono non solo genetica, ma anche neuroanatomica omologia con le loro controparti di mammiferi7,8. I saggi standard per la misurazione dello stress possono essere abbinati a linee pesce zebra che ospitano mutazioni genetiche, o quelle in cui è possibile la manipolazione di precisi sottogruppi neuronali, e gli effetti di singoli geni o neuroni definiti possono essere valutati rapidamente ed efficientemente.
Comportamentoralmente, le risposte allo stress possono essere caratterizzate nel pesce come periodi di iper-attività o periodi prolungati di inattività (simile al “congelamento”)9, ridotta esplorazione10, respirazione rapida, riduzione dell’assunzione di cibo11, e un posto-preferenza per il fondo di un serbatoio12. Ad esempio, se collocati in un serbatoio sconosciuto, i pesci zebra adulti e altri piccoli modelli di pesce mostrano una preferenza iniziale per la metà inferiore del serbatoio, eppure, nel corso del tempo, i pesci iniziano a esplorare le metà superiore e inferiore con una frequenza quasi uguale a12. Trattamento di adulti con farmaci noti per ridurre l’ansia causano pesci di esplorare immediatamente la metà superiore10,13. Al contrario, farmaci che aumentano l’ansia causano pesci a mostrare forte preferenza per la metà inferiore del serbatoio12,14,15. Così, ridotta esplorazione e preferenza per la metà inferiore del serbatoio sono indicatori semplici e affidabili di stress.
Come la maggior parte dei vertebrati, le risposte allo stress nei pesci sono guidate dall’attivazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-Inter-renale (HPI; analogo all’asse ipotalamo-pituitario-surrenale [hPa] nei mammiferi)14,16. Neuroni ipotalamici che esprimono l’ormone corticotropin-releasing hormone (CRH) segnale per l’ipofisi, che a sua volta rilascia adrenocorticotropico rilascio dell’ormone (ACTH). ACTH poi segnala alla ghiandola Inter-renale per produrre e secernere cortisolo, che ha un numero di bersagli a valle16, uno dei quali è il feedback negativo dei neuroni ipotalamici che producono CRH3,17, 18,19.
Qui descriviamo un metodo per valutare le misure comportamentali dello stress innato. Per il comportamento, abbiamo dettagliato i protocolli utilizzando il romanzo Tank Diving test12,14. Abbiamo poi dimostrare, ad esempio, che un farmaco ansiolitico noto, Buspirone, riduce le misure comportamentali dello stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish Mostra una solida risposta allo stress in un nuovo carro armato
Qui, descriviamo un approccio comportamentale semplice per esaminare le risposte di stress nel pesce zebra adulto, e convalidare l’approccio come una semplice misura di stress utilizzando farmacologia.
Il nuovo test del carro armato è un test ampiamente usato per esaminare lo stress innato nel pesce zebra e in altre specie di pesci12,14,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti della Jupiter Life Science Initiative alla Florida Atlantic University fino a ERD e ACK. Quest’opera è stata sostenuta anche da sovvenzioni R21NS105071 (assegnate a ACK e ERD) e R15MH118625 (assegnate a ERD) presso gli istituti nazionali di sanità.
Materials
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
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