Adfærdsmæssige tilgange til at studere medfødte stress i Zebrafish
Summary
Dette manuskript beskriver en enkel metode til at måle stress Behavioral hos voksne zebrafisk. Tilgangen udnytter den medfødte tendens, at: zebrafisk foretrækker den nederste halvdel af en tank, når den er i en stresset tilstand. Vi beskriver også metoder til at sammenkoble analysen med farmakologi.
Abstract
Reagerer hensigtsmæssigt på stressende stimuli er afgørende for overlevelse af en organisme. Omfattende forskning er blevet udført på et bredt spektrum af stress-relaterede sygdomme og psykiske lidelser, men endnu yderligere undersøgelser af den genetiske og neuronal regulering af stress er stadig nødvendige for at udvikle bedre terapeutisk. Den: zebrafisk giver en kraftfuld genetisk model til at undersøge neurale fundament af stress, da der findes en stor samling af mutante og transgene linjer. Desuden, farmakologi kan nemt anvendes til zebrafish, som de fleste stoffer kan tilsættes direkte til vand. Vi beskriver her brugen af ‘ roman tank test ‘ som en metode til at studere medfødte stress reaktioner i zebrafish, og demonstrere, hvordan potentielle angstdæmpende medicin kan valideres ved hjælp af analysen. Metoden kan nemt kombineres med zebrafiske linjer, der harkedeligt genetiske mutationer, eller dem, hvor transgene tilgange til manipulation af præcise neurale kredsløb anvendes. Analysen kan også anvendes i andre fiske modeller. Sammen bør den beskrevne protokol lette vedtagelsen af denne enkle analyse til andre laboratorier.
Introduction
Stress respons er ændret adfærdsmæssige og fysiologiske tilstande som følge af potentielt skadelige eller aversiv stimuli. Stress respons er bevaret i hele dyreriget, og er afgørende for overlevelsen af en organisme1. Årtiers forskning har i høj grad udvidet vores viden om nogle af de genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress stater. I dag, områder af hjernen såsom amygdala og striatum2, og genetiske faktorer såsom kortikotropin releasing hormon (CRH), og glukokortikoid (gr) og mineralokortikoid receptorer ( Mr) er blevet undersøgtudførligt 3,4,5,6. På trods af disse kritiske fund, er meget stadig ukendt om genetiske og neuronal regulering af stress. Som sådan, mange stress relaterede lidelser lider af en mangel på terapeutika.
Genetisk ændrbare modelorganismer giver et nyttigt redskab i studiet af genetiske og neuronal kontrol af adfærd. Især fiske modeller er ekstremt kraftige: de er små organismer med korte genererings tider, deres anvendelse i laboratorieomgivelser er facile, deres genomer er nemme at ændre, og som hvirveldyr deler de ikke kun genetiske, men også Neuro anatomiske Homologi med deres pattedyr modparter7,8. Standard analyser til måling af stress kan kombineres med: zebrafisk linjer, der husly genetiske mutationer, eller dem, hvor manipulation af præcise neuronal delmængder er muligt, og virkningerne af enkelt gener eller definerede neuroner kan vurderes hurtigt og effektivt.
Behavioral, stress respons kan karakteriseres i fisk som perioder med Hyper-aktivitet eller længere perioder med inaktivitet (beslægtet med ‘ frysning ‘)9, reduceret udforskning10, hurtig vejrtrækning, reduceret fødeindtagelse11, og en sted-præference for bunden af en tank12. For eksempel, når de placeres i en ukendt tank, voksne: zebrafisk og andre små fisk modeller viser en indledende præference for den nederste halvdel af tanken, men med tiden, fiskene begynder at udforske top og bund halvdele med nær-lige frekvens12. Behandling af voksne med lægemidler kendt for at reducere angst forårsage fisk til at udforske umiddelbart den øverste halvdel10,13. Omvendt, lægemidler, der øger angst forårsage fisk til at vise stærk præference for den nederste halvdel af tanken12,14,15. Således, reduceret udforskning og præference for den nederste halvdel af tanken er enkle og pålidelige indikatorer for stress.
Som de fleste hvirveldyr drives stress respons i fisk af aktivering af hypothalamus-hypofyse-Inter-renal akse (HPI; analogt med hypothalamus-hypofyse-binyre [hPa]-aksen i pattedyr)14,16. Hypothalamus neuroner udtrykker hormonet kortikotropin-releasing hormon (CRH) signal til hypofysen, som igen frigiver adrenocorticotropt releasing hormon (ACTH). ACTH derefter signaler til den inter-renal kirtel til at producere og udskille cortisol, som har en række downstream mål16, en af dem er negativ feedback på den CRH-producerende hypothalamus neuroner3,17, 18,19.
Her beskriver vi en metode til at vurdere adfærdsmæssige målinger af medfødte stress. For den opførsel, vi detalje protokoller ved hjælp af roman tank dykning test12,14. Vi derefter demonstrere, som et eksempel, at en kendt angstdæmpende stof, buspiron, reducerer adfærdsmæssige målinger af stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish udviser en robust stress respons i en ny tank
Her beskriver vi en simpel adfærdsmæssig tilgang til at undersøge stress responser i voksne zebrafisk, og validere tilgangen som en simpel måling af stress ved hjælp af farmakologi.
Den nye tank test er en meget anvendt test for at undersøge medfødte stress i: zebrafisk og andre arter af fisk12,14,21,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Jupiter Life Science Initiative på Florida Atlantic University til ERD og ACK. Dette arbejde blev også støttet af tilskud R21NS105071 (tildelt ACK og ERD) og R15MH118625 (tildelt ERD) fra National Institutes of Health.
Materials
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7 (4371), (2017).
- Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. , (2013).
- Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. , (2015).
- Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. , (2000).
- Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22 (1), 27-36 (2011).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. , (2001).
- Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27 (14), 2154-2162 (2017).
- Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15847-15859 (2015).
- Øverli, &. #. 2. 1. 6. ;., Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. , (2006).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. , (2012).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. , (2009).
- Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. , (2013).
- Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. , (2004).
- Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. , (1987).
- Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), (2015).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208 (2), 450-457 (2010).
- Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85 (2), 142-150 (2010).
- Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. , (1998).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2010).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39 (3), 255-261 (2006).
- Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25 (4), 193-201 (1992).
- Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. , (2012).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2011).
- Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. , (2014).
- Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. , (2015).
- Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40 (7), 494-500 (1988).
- Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2001).
- Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
- Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
- Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. , (2017).
- York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
- Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. , (2007).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. , (2018).
- Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214 (2), 157-171 (2010).
- Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , 181-189 (2012).
- Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13 (11), 1354-1356 (2010).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. , (2012).
- Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. , (2018).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. , 7 (2013).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. , (2015).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046 (18), 30011-30012 (2018).
- Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. , (2017).
- Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. , (2012).
- Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66 (3), 433-440 (2014).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. , (2015).
