Behavioral tilnærminger til å studere medfødte stress i sebrafisk

Summary

Dette manuskriptet beskriver en enkel metode for å måle stress behaviorally i voksen sebrafisk. Tilnærmingen utnytter den medfødte tendensen som sebrafisk foretrekker den nederste halvdelen av en tank når du er i en stressende tilstand. Vi beskriver også metoder for kobling analysen med farmakologi.

Abstract

Å reagere hensiktsmessig på stressende stimuli er avgjørende for å overleve kroppen. Omfattende forskning er gjort på et bredt spekter av stress-relaterte sykdommer og psykiatriske lidelser, men videre studier i genetisk og neuronal regulering av stress er fortsatt nødvendig for å utvikle bedre legemiddel selskap. Den sebrafisk gir en kraftig genetisk modell for å undersøke neural grunnlaget av stress, da det finnes en stor samling av mutant og transgene linjer. Videre kan farmakologi lett bli brukt til sebrafisk, som de fleste stoffene kan legges direkte til vann. Vi beskriver her bruk av “romanen tank test” som en metode for å studere medfødt stress svar i sebrafisk, og demonstrere hvordan potensielle angstdempende medikamenter kan bli validert ved hjelp av analysen. Metoden kan enkelt kombineres med sebrafisk linjer harboring genetiske mutasjoner, eller de der transgene tilnærminger for å manipulere presise nevrale kretser brukes. Analysen kan også brukes i andre fiske modeller. Sammen bør den beskrevne protokollen forenkle innføringen av denne enkle analysen til andre laboratorier.

Introduction

Stress responsen er endret atferdsmessige og fysiologiske tilstander som følge av potensielt skadelige eller aversive stimuli. Stress responser bevares i dyreriket, og er avgjørende for overlevelse av en organisme¹. Ti år med forskning har i stor grad utvidet vår kunnskap om noen av de genetiske og neuronal mekanismer underliggende stress tilstander. I dag, områder av hjernen som amygdala og striatum², og genetiske faktorer som corticotropin slippe hormon (CRH), og glukokortikoid (gr) og mineralocorticoid reseptorer ( Mr) har blitt studert mye^3,4,5,6. Til tross for disse kritiske funnene, er mye fortsatt ukjent om genetisk og neuronal regulering av stress. Som sådan, mange stress relaterte lidelser lider av en mangel på legemiddel.

Genetisk amendable modell organismer gir et nyttig verktøy i studiet av genetisk og neuronal kontroll av atferd. Fisk modeller, i særdeleshet, er ekstremt kraftig: de er små organismer med kort generasjon ganger, deres bruk i et laboratorium innstillingen er facile, deres genomer er lett endres, og som en virveldyr, deler de ikke bare genetisk, men også nevroanatomi homologi med sine pattedyr kolleger^7,8. Standard analyser for måling av stress kan pares med sebrafisk linjer harboring genetiske mutasjoner, eller de der manipulering av presise neuronal delsett er mulig, og virkningene av enkelt gener eller definerte neurons kan vurderes raskt og effektivt.

Behaviorally, stress svar kan karakteriseres i fisk som perioder med Hyper-aktivitet eller lengre perioder med inaktivitet (beslektet med “frysing”)⁹, redusert leting¹⁰, rask pusting, redusert matinntak¹¹, og en plass-preferanse for bunnen av en tank¹². For eksempel, når oppstilt i en ukjent tank, voksen sebrafisk og annet liten fisken modeller viser en initial preferanse for bunnen halvparten av akvariet, ennå, over tid, fisken begynne Utforsker topp og bunnen halvdeler med like ved-likeverdig hyppigheten¹². Behandling av voksne med rusmidler kjent for å redusere angst forårsake fisk å utforske umiddelbart den øverste halvdelen^10,13. Omvendt, medikamenter som øker angst forårsake fisk å vise sterke preferanse for den nederste halvdelen av tanken^12,14,15. Således, nedsatte utforskningen og preferanse for bunnen halvparten av akvariet er enkel og pålitelig indikatorene av trykk.

Som de fleste virveldyr, stress svar i fisk er drevet av aktivering av hypothalamus-hypofysen-Inter-nyre aksen (HPI; analogt til hypothalamus-hypofysen-adrenal [HPA] aksen i pattedyr)^14,16. Hypothalamus neurons uttrykker hormonet corticotropin-lanserer Hormone (CRH) signal til hypofysen, som igjen utgivelser adrenokortikotropt lanserer Hormone (ACTH). ACTH deretter signaler til Inter-renal kjertel å produsere og skiller ut kortisol, som har en rekke nedstrøms mål¹⁶, en av dem er negative tilbakemeldinger av CRH-produserende hypothalamus neurons^{3,17, 18,19}.

Her beskriver vi en metode for å vurdere atferds tiltak av medfødt stress. For atferden, vi detalj protokoller ved hjelp av romanen tank Diving test^12,14. Vi viser, som et eksempel, at en kjent angstdempende narkotika, Buspirone, reduserer atferdsmessige tiltak for stress.

Protocol

Protokollen har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committeeat Florida Atlantic University. 1. forberedelse Utpeke et isolert rom for å utføre atferds studier, eller stenge en del av et rom slik at det er isolert.Merk: rommet bør være uforstyrret og har lav trafikk for å unngå å forstyrre normal oppførsel av fisken. Flytt følgende materialer og utstyr inn i atferds rommet: (i) et kamera og objektiv, (II) en infrarød filter som kan festes til…

Representative Results

Undersøke stress i sebrafiskFor å undersøke stress atferd over tid i vill-type sebrafisk, testet vi voksen fisk fra AB belastningen24 i romanen tank test. AB voksne ble utsatt for protokollen som beskrevet ovenfor. Kort, fisken var gitt en 1-h acclimation periode inne en tank inne det opptreden rom. En person ble plassert i et beger for 10-min, og deretter plassert forsiktig i en ukjent tank (romanen tank) fylt med friskt system vann. Locomotor akti…

Discussion

Sebrafisk viser en robust stress respons i en roman tank
Her beskriver vi en enkel atferdsdata tilnærming for å undersøke stressresponser i voksen sebrafisk, og validere tilnærmingen som et enkelt mål på stress ved hjelp av farmakologi.

Romanen tank test er en mye brukt test for å undersøke medfødte stress i sebrafisk og andre arter av fisk^{12,14,21,35<…}

Materials

Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology
Buspirone chloride	Sigma-Aldrich	B7148
Randomized trial generator			We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel