使用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）致癌物诱导小鼠膀胱肿瘤。由于膀胱肿瘤的生成具有异质性，因此在将动物随机分配至实验治疗组之前，需要对肿瘤负荷进行准确评估。本文介绍了一种快速、可靠的磁共振成像（MRI）方案，用于评估肿瘤大小和分期。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠膀胱肿瘤模型对于评估新的治疗方案至关重要。使用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）致癌剂诱导的膀胱肿瘤模型相较于基于细胞系的模型具有优势，因其能更准确地模拟人类肿瘤的基因组特征，并且与细胞模型和异种移植模型不同，该模型为免疫疗法的研究提供了良好平台。然而，膀胱肿瘤的形成具有异质性，因此在将动物随机分组接受实验性治疗前，需对肿瘤负荷进行准确评估。本文所述为一种BBN诱导的小鼠模型及用于评估膀胱癌肿瘤负荷的实验方案。 体内 使用一种快速且可靠的磁共振（MR）序列（true FISP）。该方法简单且可靠，因为与超声不同，磁共振成像不受操作者影响，且便于进行直接的图像后处理与回顾。通过膀胱的轴位图像，可分析膀胱壁及肿瘤感兴趣区域，从而计算膀胱壁和肿瘤面积。该测量值与 离体 膀胱重量（rs= 0.37，p = 0.009）和肿瘤分期（p = 0.0003）。综上所述，BBN 诱导的肿瘤具有异质性，是评估免疫疗法的理想模型，而 MRI 可在随机分组至实验治疗组之前快速、可靠地评估肿瘤负荷。
引言
膀胱癌是全球第五大常见癌症，2017年在美国导致约80,000例新发病例和16,000例死亡1。在膀胱癌的全身治疗领域长达约30年缺乏重大进展之后2，近期针对PD-1和PD-L1的免疫检查点抑制剂临床试验在晚期尿路上皮癌患者中展现出令人鼓舞且有时持久的治疗反应3,4,5。然而，仅有约20%的患者对这些治疗产生客观应答，仍需进一步研究以扩大免疫治疗在膀胱癌患者中的有效应用。
小鼠膀胱癌模型是评估新型治疗方法的重要临床前工具6,7。为了在将小鼠随机分组接受不同治疗时控制肿瘤大小，必须对各治疗组之间的肿瘤负荷进行评估和控制。既往研究采用超声或生物发光技术来评估基于细胞系的原位膀胱癌模型8,9,10,11。然而，这两种技术均存在若干缺点....
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方案
本文所述所有方法均已获得西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 使用 BBN 诱导肿瘤
- 获取每只至少6周大的雄性C57/BL6小鼠。
注意：雄性小鼠比雌性小鼠发生膀胱癌的速度更快且一致性更高14,15. - 将N-亚硝基丁基(4-羟丁基)胺（BBN）以0.05%的剂量加入饮水中。储存于不透光容器中并提供给动物使用 随意摄取 作为小鼠的饮用水16.
注意：将 BBN 溶液储存在透明容器中会导致致癌物降解17. - 每周更换两次0.05% BBN水。
- 通过检查小鼠是否出现与膀胱肿瘤相关的痛苦迹象（包括血尿、膀胱变硬和肿块）来监测动物状态。每周检查小鼠两次，或依照当地实验动物管理与使用委员会（IACUC）的指导原则进行。
- 预计肿瘤将在暴露后16至24周内形成18.
2. MRI 设置
- 在MRI检查前10分钟，皮下注射无菌生理盐水（使用25–27 G针头和1 mL注射器，剂....
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结果
采用所述方案（图1），在C57/B6雄性小鼠中诱导膀胱肿瘤。在第16周进行磁共振成像（MRI），并在第20周处死小鼠。离体称量每只小鼠的膀胱重量（BW）。切片经苏木精-伊红染色，所有组织学切片均用于评估肿瘤分期。
为了利用磁共振（MR）分析肿瘤负荷，通过从膀胱壁外腔（BLAout）中减去膀胱壁内腔（BLAin）来计算膀胱壁的厚度（BLAwall）（图2）。代表性的真实FISP磁共振图像、膀胱壁三维重建图像以及对照小鼠（即无肿瘤）的病理图像如图3A-F所示，具有大肿瘤的小鼠图像如图3G-.......
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讨论
准确的肿瘤模型成像对于实验治疗开始前的安乐死前分期和动物随机分组至关重要。通过本文介绍的方法，我们展示了（1）使用BBN致癌剂诱导膀胱肿瘤，以及（2）利用磁共振成像（MR）对膀胱肿瘤负荷进行分层的实验方法。基于磁共振成像获得的面积测量值（BLA）壁) 与……存在显著相关性 离体 膀胱重量，并与病理肿瘤分期相关。
通过采用高空间分辨率（真实稳态进动快速成像，true FISP）、短采集时间且成像快速、诊断质量高的方法，我们可在肿瘤发育的中期阶段、治疗随机分组前对小鼠进行高通量检测。本报告与既往关于细胞系来源肿瘤移植的磁共振成像研究结果一致9,12，并进一步证实了该技术在优化大样本量药物研究中的应用潜力。
在本 MRI 方案中，必须在小鼠膀胱充盈的状态下进行成像，以获得高质量图像并清晰区分肿瘤与膀胱腔。我们发现，在成像前 10 分钟为每只小鼠注射生理盐水，可实现膀胱的良好显影.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
J. J. M. 由美国退伍军人健康管理局优秀奖 BX0033692-01 资助。J. J. M. 还获得了西北大学罗伯特·H·卢里综合癌症中心约翰·P·汉森癌症研究基金会的支持。我们感谢转化成像中心提供磁共振成像的采集与处理。资助方在稿件撰写或决定投稿发表过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6小鼠 | 杰克逊实验室 | 664 | 小鼠 |
| N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺致癌物（BBN） | TCI 美国 | B0938 | 致癌物 |
| 0.9%生理盐水 | Hospira, Inc | NDC 0409-488-02 | |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare | 60307-120-25 | 麻醉剂 |
| 7Tesla ClinScan MRI | 布鲁克 | NA | 专用小型动物成像磁共振成像 |
| Syngo | 西门子 | NA | MR一体化成像软件 |
| Model 1030 监测 &和门控系统 | 小型动物仪器公司（SAII） | NA | 小型动物生理监测 |
| 中性缓冲福尔马林，10% | Sigma | HT501128 | 固定剂 |
| 伊红Y | Fisher Scientific | NC1093844 | 组织学染色剂 |
| 苏木精 | Fisher Scientific | 23-245651 | 组织学染色剂 |
| Jim7 | Xinapse Systems | NA | 医学图像分析软件 |
| GraphPad Prism v7.04 | Graphpad | NA | 绘图软件 |
| R v3.4.2 | 统计计算 R 项目 | NA | 统计软件 |
| R 包 pROC v1.10.0 | 统计计算 R 项目 | NA | ROC分析 |
参考文献
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a tre....
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重印与许可
