Isolement et transfert adoptif de sel élevé traités des cellules dendritiques présentatrices d’antigène

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules dendritiques des rates murins de tri cellulaire magnétique et transfert adoptif en souris naïves de. Le modèle de cellules dendritiques activées de haut-sel a été choisi pour expliquer la procédure étape par étape de transfert adoptif et cytométrie en flux.

Résumé

La prise excessive de sel alimentaire contribue à l’inflammation et joue un rôle essentiel dans le développement de l’hypertension. Précédemment, nous avons constaté que les cellules dendritiques présentatrices d’antigènes (CD) sent élevées de sodium extracellulaire conduisant à l’activation de la NADPH oxydase et la formation d’isolevuglandin (IsoLG)-protéines adduits. Ces IsoLG-protéines adduits réagissent avec le self-protéines et promouvoir un état autoimmun-like et hypertension. Nous avons développé et optimisé state-of-the-art des méthodes pour étudier la fonction DC dans l’hypertension. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement, dans vitro traitement avec sodium élevé et transfert adoptif de murin CD11c splénique⁺ des cellules dans des souris destinataires afin d’étudier leur rôle dans l’hypertension.

Introduction

Excès de sel alimentaire est un facteur de risque majeur pour l’hypertension. ^{1 , 2} the American Heart Association recommande un maximum de 2 300 milligrammes (mg) de l’apport en sodium (Na⁺) par jour, cependant ; moins de 10 % de la population américaine observe cette recommandation. ^{3 , 4} réduction modeste apport Na⁺ abaisser la pression artérielle et réduire les nouveaux cas annuels de cardiopathies coronariennes et des accidents vasculaires cérébraux aux Etats-Unis de 20 %. ⁵ un problème majeur avec la ....

Protocole

De l’Université Vanderbilt animalier institutionnel et Comité d’urbanisme ont approuvé les procédures décrites dans les présentes. Souris sont logés et pris en charge conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Révisée en 2010).

1. isolement des rates de souris

1. Préparer le RPMI 1640 : 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, pyruvate de sodium 1 mM, 50 µM β-mercaptoéthanol et 1 % la pénicilline/streptomycine.
2. Euthanasier 10 – 12 semaines-vieilles souris mâles C57bl/6 par inhalation de CO₂ . Vaporiser la poitrine et les côtés de la souris avec l’éthanol à 70 %. Sur ....

Résultats

La figure 1 représente une représentation schématique des étapes décrites ci-dessus. Spleens murins isolés sont triés pour CD11c⁺ DCs par cellule magnétique, tri et plaqué dans les médias sels normales (NS ; 150 mmol de NaCl) ou forte media sel (HS ; 190 mmol NaCl) pendant 48 h. CD11c⁺ DCs moutschen acheminés par rétro-orbitaire injection pour les bénéficiaires souris naïves. Dix jours plus tard, les souris sont implantés avec des minipo.......

Discussion

Dans le protocole actuel, nous avons optimisé les procédures pour isoler CD11c⁺ DCs des rates de souris et moutschen de transférer dans des animaux naïfs pour étudier le rôle des contrôleurs de domaine dans l’hypertension induite par le sel. Ce protocole peut être adapté pour isoler et transfert moutschen autres sous-ensembles de cellules immunitaires, dont les macrophages, les monocytes et les cellules immunitaires adaptatives dont les lymphocytes T et B. Nous avons optimisé le processus de digestion spléniqu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
APC/Cy7 anti-souris CD11c Biolegend		117324
tampon de fonctionnement autoMACS  ;	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Microbilles Ultrapures  ;	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagénase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS sans calcium et magnésium	Corning	21-031-CV
FcR Réactif bloquant	Miltenyi Biotec	; 130-092-575
FITC anti-souris CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
Dispositif de dissociation GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Protocole d’utilisation : Rate 04.01
LIVE/DEAD fixable violet kit de coloration des cellules mortes	violettes Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Séparateur QuadroMACs Biotec	130-042-401
;	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 moyen  ;	Gibco	11835-030