यह प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 + t सेल सक्रियण में आणविक बातचीत की जांच करने के लिए एकल श्रृंखला mhc वर्ग I परिसरों के उपयोग का वर्णन करता है: इंजीनियर antigen की पीढ़ी के एकल श्रृंखला व्यक्त कोशिकाओं का निर्माण, मानव सीडी 8 + टी सेल क्लोन की संस्कृति और टी सेल सक्रियण प्रयोगों ।
गैर-उत्तेजक स्व पेप्टाइड mhc (pmhc) परिसरों टी सेल सक्रियण और effector कार्यों को प्रेरित नहीं करते, लेकिन सह-agonism कहा एक प्रक्रिया के माध्यम से, एगोनिस्ट pmhc के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक प्रणाली मानव सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के दौरान मानव mhc वर्ग मैं एक xenogeneic सेल लाइन में एकल polypeptides (एकल श्रृंखला mhc) के रूप में पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स पेश अणुओं व्यक्त करके सह-agonism की जांच करने के लिए वर्णन करता है । हमने एकल श्रृंखला mhcs को शर्तों के तहत व्यक्त किया जहां एगोनिस्ट सिंगल चेन पी-एमएचसी परिसरों और गैर-उत्तेजक एकल श्रृंखला पी-एमएचसी परिसरों के उच्च स्तर के निम्न स्तर व्यक्त किए गए थे । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग हमें गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc के लिए सीडी 8 + T सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति दी । प्रोटोकॉल एकल श्रृंखला mhc constructs, स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी, हेपेटाइटिस बी वायरस-विशिष्ट मानव सीडी 8 + टी कोशिकाओं और टी सेल सक्रियण प्रयोगों के साथ सेल लाइन ट्रांसफक्शन का वर्णन एक साथ साइटोकाइन उत्पादन बढ़ाता और विकणीकरण. प्रस्तुत तरीके ज्ञात पेप्टाइड mhc विशिष्टता के साथ मानव टी सेल सिस्टम में सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के विभिन्न पहलुओं पर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
mhc वर्ग i (mhc-i) अणु उपस्थित लघुतम (8-10 अमीनो अम्ल) प्रत्येक कोशिका द्वारा संश्लेषित प्रोटीन से प्राप्त पेप्टाइड्स. mhc-I स्वस्थ कोशिकाओं पर अणु मौजूद स्व पेप्टाइड्स अंतर्जात प्रोटीन से व्युत्पन्न. वायरल संक्रमण गैर स्वयं वायरस की प्रस्तुति की ओर जाता है-mhc-I पर पेप्टाइड्स व्युत्पंन, लेकिन यहां तक कि संक्रमित कोशिकाओं स्वयं पेप्टाइड-mhc (pmhc) की बड़ी मात्रा की उपस्थिति में गैर स्वयं पेप्टाइड उपस्थित. mhc-मैं टी सेल रिसेप्टर (tcr) और टी कोशिकाओं पर सीडी 8 सह रिसेप्टर द्वारा मांयता प्राप्त है । पेप्टाइड pmhc के लिए बाध्यकारी संबंध tcr अत्यधिक प्रस्तुत पेप्टाइड्स के अनुक्रम पर निर्भर है, जबकि सीडी 8 बाध्यकारी पेप्टाइड-स्वतंत्र है. गैर-स्व एगोनिस्ट pmhc जटिल करने के लिए बाइंडिंग tcr टी सेल सक्रियण और effector कार्यों के लिए सुराग । गैर-उत्तेजक स्व pmhc परिसरों टी सेल सक्रियण और effector कार्यों को प्रेरित नहीं करते हैं, लेकिन एक प्रक्रिया के माध्यम से एगोनिस्ट pmhc के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ा सकते हैं, सह-agonism1,2,3कहा जाता है । माउस सीडी4,5,6 के साथ-साथ माउस और मानव सीडी 8 + t कोशिकाओं मेंसह-एगोनिज्म को देखा गया है7,8,9,10, 11 , 12 , 13. शारीरिक स्थितियों के तहत, टी कोशिकाओं को एगोनिस्ट pmhc की सीमित मात्रा में antigen पेश कोशिकाओं (apcs) सह गैर उत्तेजक pmhc परिसरों के उच्च स्तर पेश करने की पहचान करने की जरूरत है, कि सह-agonism का सुझाव देता है इष्टतम टी विवो में सेल प्रतिक्रियाएं । कुल सेल सतह mhc वर्ग मैं स्तर अक्सर वायरल संक्रमण के दौरान downregulated कर रहे हैं14 और ट्यूमर पर15. इस प्रतिरक्षा चोरी रणनीति एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति कम कर देता है, लेकिन यह भी सह एगोनिस्ट pmhc मैं टी सेल सक्रियण संवर्धन के लिए उपलब्ध की राशि कम हो जाती है । इसके अलावा, उच्च सेल mhc वर्ग मैं अणु hla-सी की सतह अभिव्यक्ति स्तर में सुधार एचआईवी नियंत्रण16के साथ सहसंबंधी दिखाया गया है, कुल mhc वर्ग टी सेल सक्रियकरण में मैं अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव । सह-एगोनिज़्म के शारीरिक महत्व के बावजूद, इसकी आणविक तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में आता है । यह मुख्यतः एगोनिस्ट pmhc लगातार रखते हुए प्रस्तुत सह-एगोनिस्ट pmhc की मात्रा को नियंत्रित करने की तकनीकी चुनौतियों के कारण है ।
हम एक प्रयोगात्मक प्रणाली विकसित की जांच करने के लिए मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism मानव mhc वर्ग व्यक्त करके मैं एक xenogeneic कोशिका में एकल पॉलीपेप्टाइड (सिंगल चेन mhc-I, चित्रा 1a) के रूप में पूर्व निर्धारित पेप्टाइड प्रस्तुत अणुओं लाइन9,10. एकल श्रृंखला (sc) एगोनिस्ट pmhc टेट्रासाइक्लिन के नियंत्रण में व्यक्त किया गया था-हंसटर-व्युत्पन्न टी-रेक्स चो सेल लाइन टेट्रासाइक्लिन repressor व्यक्त करने में यह टेट्रासाइक्लिन (चित्र 1b, C) के अतिरिक्त टेट्रासाइक्लिन और उच्च sc एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति के अभाव में sc एगोनिस्ट pmhc की बहुत कम “टपका” अभिव्यक्ति की अनुमति देता है । एससी एगोनिस्ट pmhc-एक्सप्रेस टी-रेक्स चो कोशिकाओं को गैर-उत्तेजक, सह-एगोनिस्ट एससी pmhc-I के साथ एक संवैधानिक रूप से सक्रिय प्रमोटर (चित्रा 1b, सी) के नियंत्रण में सुपरट्रांसफेक्टेड किया गया था । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग हमें गैर-उत्तेजक pmhc के उच्च स्तर की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc के लिए सीडी 8 + T सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करने की अनुमति दी. गंभीर रूप से, पेप्टाइड और mhc-मैं भारी श्रृंखला के बाद से covalently scmhc-I प्रारूप में जुड़े हुए हैं, यह mhc पूर्व-निर्धारित पेप्टाइड्स पेश अणुओं में परिवर्तन की महत्मकताओं की अनुमति देता है. scmhc-I प्रौद्योगिकी का उपयोग इस प्रकार हमें विशेष रूप से टीसीआर या सीडी 8-एगोनिस्ट या सह-एगोनिस्ट pmhc के बंधन गुण मिलाना करने की अनुमति दी ।
सीडी 8 + टी सेल सक्रियण में सह-एगोनिज्म का उपयोग करके देखा गया है शुद्ध mhc-मैं एगोनिस्ट और सह-एगोनिस्ट पेप्टाइड्स पेश करने के रूप में विषमलिंगी11,17 या क्वांटम डॉट्स12,13पर प्रस्तुत किया । एपीसी पर एगोनिस्ट pmhc मान्यता के संदर्भ में सीडी 8 + T सेल सक्रियण में सह-agonism पर जल्दी काम apc के रूप में TAP2 कमी सेल लाइनों का इस्तेमाल किया । ठोकर अंतर्द्रव्यी रेटिकुलम के लिए कोशिका द्रव्य से पेप्टाइड परिवहन के लिए आवश्यक है, और नल की कमी गंभीर रूप से उपलब्ध mhc वर्ग के पूल मैं-बाध्यकारी पेप्टाइड्स कम कर देता है. पेप्टाइड्स की अनुपस्थिति में, mhc वर्ग के नवजात जटिल मैं भारी श्रृंखला और β2-microglobulin अस्थिर है, बहुत कम mhc-I सेल सतह अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप. प्रारंभ में, नल-पर्याप्त और कमी माउस rma और rma-S सेल लाइनों पर लोड किए गए antigen के साथ प्रेरित टी कोशिकाओं की तुलना, क्रमशः एपीसीएस के रूप में, माउस टी सेल सक्रियण18के दौरान सह-एगोनिज्म के लिए कोई सबूत प्रकट नहीं किया । हालांकि, इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग एगोनिस्ट pmhc की राशि पर सटीक नियंत्रण की अनुमति नहीं दी गैर उत्तेजक स्वयं pmhc के स्वतंत्र रूप से प्रस्तुत किया । इसके अलावा, ये दो कोशिका रेखाएँ अन्य अणुओं की अभिव्यक्ति में भी भिन्न हो सकती हैं जो टी सेल सक्रियण को मिलाना, जैसे लिगंडा को टी सेल सह-उत्तेजक या निरोधात्मक रिसेप्टर्स, या आसंजन अणुओं के रूप में.
इसके बाद, हम exogenous पेप्टाइड्स के साथ TAP2 कमी RMA-S कोशिकाओं को लोड करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एगोनिस्ट pmhc की एक निश्चित राशि की प्रस्तुति की अनुमति देने के लिए. यह निम्नलिखित के माध्यम से प्राप्त किया गया था: कम तापमान पर TAP2 की कमी आरएमए-एस कोशिकाओं की ऊष्मायन (28 डिग्री सेल्सियस, सामान्य ३७ डिग्री सेल्सियस के बजाय) खाली mhc वर्ग को स्थिर करने के लिए मैं भारी श्रृंखला/β2 microglobulin परिसरों19; exogenous एगोनिस्ट पेप्टाइड के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन; exogenous गैर-उत्तेजक पेप्टाइड की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन; और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन खाली mhc वर्ग के सेल सतह अभिव्यक्ति को कम करने के लिए मैं8,9परिसरों । इस प्रयोगात्मक सेट अप का उपयोग पता चला है कि गैर उत्तेजक pmhc की उपस्थिति माउस thymocytes, भोली परिधीय सीडी 8 + टी कोशिकाओं और ctls8की सक्रियता बढ़ाया । यंत्रवत्, गैर-उत्तेजक pmhc की उपस्थिति टी सेल के लिए सीडी 8 भर्ती पैदा कर सकते हैं: एपीसी प्रतिरक्षा synapse भी एगोनिस्ट pmhc की अनुपस्थिति में, और गैर-उत्तेजक pmhc सीडी 8 coreceptor7,8के साथ टीसीआर बातचीत में वृद्धि कर सकते हैं. हालांकि, इस प्रयोगात्मक प्रणाली tcr और सीडी 8 के सापेक्ष योगदान परीक्षण की अनुमति नहीं है एगोनिस्ट और सह के लिए बाइंडिंग coreceptor सक्रियण संवर्धन mediating में, किसी भी संशोधन के रूप में tcr या सीडी 8 mhc वर्ग के लिए बाध्यकारी मैं चाहूंगा सभी mhc अणुओं को प्रभावित, प्रस्तुत पेप्टाइड की परवाह किए बिना. इसलिए हम इस समस्या से उबरने के लिए mhc वर्ग मैं एकल श्रृंखला प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया ।
एकल श्रृंखला (अनुसूचित जाति) mhc वर्ग मैं प्रारूप पहले चिकित्सकीय रणनीतियों के लिए प्रतिजनी pmhc प्रस्तुति में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और tcr और nk सेल रिसेप्टर सक्रियण और समारोह के तंत्र पर मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए20,21 . scmhc-मैं पेप्टाइड के होते हैं, β2-microglobulin और mhc-मैं भारी श्रृंखला में शामिल हो गए दो लचीला serine/glycine-रिच linkers (चित्रा 1a), कई अलग linkers दृश्यों विकसित किया गया है और परीक्षण22. scmhc-मैं पारंपरिक pmhc परिसर20विधानसभा के लिए आवश्यक नल जटिल और निगरानी प्रोटीन के स्वतंत्र रूप से गुना कर सकते हैं. scmhc-मैं सही ढंग से गुना करने के लिए दिखाया गया है, के रूप में conformation विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला22 का उपयोग कर और एक्स-रे क्रि23के साथ अनुसूचित जाति संरचना को सुलझाने के द्वारा निर्धारित किया है । बुनियादी scmhc-मैं डिजाइन कम संबध24,25पेप्टाइड्स के बंधन में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया है.
इस प्रोटोकॉल मानव scmhc का उपयोग-मैं मानव ctl क्लोन सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच करने के लिए वर्णन करता है । प्रोटोकॉल हेपेटाइटिस बी वायरस (hbv) के एक epitope के लिए मानव ctl क्लोन विशिष्ट के लिए अनुकूलित किया गया है । hbv एक गंभीर हेल्थकेयर बोझ दुनिया भर में है, के रूप में वहां रहे है ३५०,०००,००० hbv और क्रोनिक hbv संक्रमण से संक्रमित लोगों हेपेटोकोशिलर कार्सिनोमा (hcc) के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एचबीवी संक्रमण से उत्पन्न hcc कोशिकाओं को आमतौर पर एचबीवी-व्युत्पन्न epitopes मौजूद कर सकते हैं और विशिष्ट मानव टी कोशिकाओं द्वारा पहचाना जा सकता है । hbv और hcc मंजूरी मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है26, लेकिन hcc रोगियों अक्सर टी सेल थकावट और कम टी सेल प्रतिक्रियाएं27से ग्रस्त हैं । एचबीवी की टी कोशिकाओं में hbv-विशिष्ट tcr की शुरूआत क्रोनिक एचबीवी संक्रमण को खत्म करने के लिए एक संभावित immunotherapy रणनीति के रूप में की कोशिश की गई है28. हालांकि, यह अज्ञात है अगर इस विधि एक नैदानिक सेटिंग में प्रभावी हो जाएगा, सतह mhc के निम्न स्तर के कारण-मैं मानव hepatocytes में29. इसलिए, coagonism के तंत्र को समझने hbv के immunotherapy के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं, संभवतः अंतर्जात pmhc की प्रस्तुति को बढ़ाने के लिए सह-agonism-मध्यस्थता टी सेल प्रतिक्रियाओं प्रेरित । प्रोटोकॉल मानव सह-एगोनिज्म पर अनुसंधान के लिए सभी आवश्यक कदम शामिल हैं: एगोनिस्ट और सह-एगोनिस्ट अनुसूचित जाति pmhc, स्थिर टी-रेक्स चो सेल लाइनों की संस्कृति, hbv-विशिष्ट मानव ctl सीडी 8 + टी सेल लाइन और सीटीएल सक्रियण की पीढ़ी के साथ टी-रेक्स चो कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन प्रयोगों को बढ़ाता साइटोक्सीन उत्पादन और विकणीकरण टी-रेक्स चो कोशिकाओं के जवाब में. हालांकि हम अनुसूचित जाति mhc वर्ग मैं प्रौद्योगिकी hbv टी सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रस्तुत तरीके आसानी से ज्ञात pmhc के साथ मानव टी सेल सिस्टम में टी सेल सक्रियण के अन्य पहलुओं पर अनुसंधान के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-I विशिष्टता.
यह प्रोटोकॉल hbv व्युत्पन्न पेप्टाइड E183-91 (flltrilti: “E183”)30 hla-A2 पर प्रस्तुत के लिए एक मानव सीडी 8 + ctl लाइन विशिष्ट का उपयोग करता है । sc hla मानव β2 से एक संकेत अनुक्रम से मिलकर अणुओं-microglobulin, एक hla-A2 ब्याज की पेप्टाइड बाइंडिंग, एक glycine/serine linker, एक मानव β2-microglobulin, एक glycine/serine लिंकर और एक A2 भारी श्रृंखला व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है (चित्र 1a ). plasmids एन्कोडिंग scA2 एगोनिस्ट E183 पेप्टाइड के साथ constructs, या coagonist एचआईवी गैग (slyntvatl)31 पेप्टाइड्स अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध हैं. पेप्टाइड अनुक्रम साइट का उपयोग कर परिवर्तित किया जा सकता है निर्देशित-mutagenesis. एक टेट्रासाइक्लिन-inducible वेक्टर pcDNA5/करने के लिए E183 पेप्टाइड के साथ एगोनिस्ट एकल श्रृंखला hla-a2 व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (sc E183-hla-a2). टेट्रासाइक्लिन repressor की उपस्थिति में, pcDNA5/करने के लिए प्लाज्मिड केवल बहुत कम, ब्याज की प्रोटीन की “नलों” अभिव्यक्ति की अनुमति देता है; उच्च अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन (चित्रा 1b, सी) के अलावा द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग सेल सतह एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति की मात्रा पर नियंत्रण की अनुमति देता है । एक संवैधानिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pcdna 3.1 गैग पेप्टाइड (sc gag-hla-A2) के साथ coagonist scA2 व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । टेट्रासाइक्लिन विनियमित अभिव्यक्ति (टी-रेक्स) चो सेल लाइन (हैम्स्टर सेल लाइन, कोई अंतर्जात मानव mhc) को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था एगोनिस्ट और सह-एगोनिस्ट अनुसूचित जाति-एचएलए-A2 constructs. इस प्रयोगात्मक प्रणाली pmhc प्रस्तुति पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है (चित्रा 1c): नहीं pmhc प्रस्तुति (untransfected टी-रेक्स), सह-एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति की एक उच्च राशि (संवैधानिक अनुसूचित जाति झूठ-hla-A2 अभिव्यक्ति), एगोनिस्ट pmhc की एक कम राशि प्रस्तुति (sc E183-hla-a2 टेट्रासाइक्लिन की अनुपस्थिति में), एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति की एक उच्च मात्रा (sc E183-hla-a2 टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में), एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति और सह-एगोनिस्ट pmhc की उच्च अभिव्यक्ति की एक कम राशि (sc E183-hla-a2 टेट्रासाइक्लिन की अनुपस्थिति, और संवैधानिक अनुसूचित जाति झूठ-hla-A2 अभिव्यक्ति) । इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग एगोनिस्ट और coagonist pmhc के सेल सतह मात्रा के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव सीडी 8 + T सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है । मानव टी सेल सक्रियण के दौरान सह-एगोनिज्म की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एगोनिस्ट pmhc सेल सतह अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के साथ या सह-एगोनिस्ट pmhc अभिव्यक्ति के बिना apcs पर बराबर एगोनिस्ट pmhc प्रस्तुति सुनिश्चित करने के लिए है । हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली में, यह एक एकल सेल क्लोन का उपयोग करके हासिल की कम मात्रा में एगोनिस्ट pmhc, एक सह-एगोनिस्ट pmhc का निर्माण और एगोनिस्ट pmhc का उपयोग कर के साथ supertransfection द्वारा पीछा किया जाता है tcr-एंटीबॉडी की तरह10, ३२. के रूप में एगोनिस्ट sc pmhc अभिव्यक्ति समय के साथ बदल सकते हैं, यह tcr की तरह एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया apcs पर एगोनिस्ट pmhc सतह अभिव्यक्ति यों तो करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि कोई विशिष्ट tcr-एंटीबॉडी की तरह उपलब्ध है, एगोनिस्ट scmhc-मैं फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, और उसके सेल सतह अभिव्यक्ति तो कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में एक संवेदनशील माइक्रोस्कोपी विधि, का उपयोग कर मात्रा निर्धारित जा सकता है ३५ , ३६. इसके अलावा, सह-agonist pmhc की सेल सतह अभिव्यक्ति समय के साथ कम हो जाती है, के कारण methylation निर्भर और-स्वतंत्र cmv प्रवर्तक३७के मुंह बंद, और निगरानी की जानी चाहिए एंटीबॉडी धुंधला और प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर, के साथ दोहराया facs-छंटाई जब जरूरत है । हम अनुसूचित जाति pmhc अभिव्यक्ति के अपेक्षाकृत सीमित नुकसान के साथ 5 हफ्तों तक के लिए सुसंस्कृत चो कोशिकाओं है । हम अत्यधिक सुझा है चो कोशिकाओं को जल्दी ही चयन के बाद ठंड ज्ञात अनुसूचित जाति mhc अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का एक विश्वसनीय शेयर सुनिश्चित करने के लिए/
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कई कदम संशोधित किया जा सकता है, उपकरणों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, या विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्य पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, pbmc प्रसार क्षमता हिचकते किया जा सकता (3.2.1 कदम) वैकल्पिक तरीकों कि एक गामा की आवश्यकता नहीं है का उपयोग कर (या एक्स-) irradiator, ऐसे मीतोमयसीं सी३८के साथ उपचार के रूप में. एक गैर enzymatic सेल वियोजन बफ़र्स धातु chelators३९ युक्त के बजाय कदम में scraping सेल 3.3.1 का इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, antigen पेश प्रणाली इसे और अधिक मानव ctl क्लोन अलग tcrs व्यक्त करने के लिए उपयुक्त बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । चो कोशिकाओं हंसटर mhc वर्ग मैं अणुओं एक्सप्रेस, और यद्यपि इन ctl लाइन के लिए अप्रासंगिक है यहां का अध्ययन (चित्रा 2a और चित्रा 3a, हम कोई टी सेल प्रतिक्रियाओं को मनाया चो कोशिकाओं अनट्रांसफेक्टेड), वहां एक संभावना है कि अंय मानव tcrs कुछ xenoreactivity दिखा सकता है । उस मामले में, हैम्स्टर mhc वर्ग मैं अभिव्यक्ति हंसटर β2 दस्तक द्वारा कम किया जा सकता है-microglubulin या crispr का उपयोग कर नल/Cas9; या एक मानव apc लाइन crispr के बाद इस्तेमाल किया जा सकता/Cas9-mediated β2-microglubulin या ठोकर बाहर दस्तक ।
प्रायोगिक प्रणाली यहां प्रस्तुत tcr और mhc पूर्व परिभाषित पेप्टाइड्स पेश अणुओं के साथ सीडी 8 बातचीत के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, हम पहले से पता चला है कि परिवर्तन सीडी 8 बाध्यकारी coagonist pmhc को समाप्त करने के लिए coagonist-मध्यस्थता सक्रियण मुरीन और मानव सीडी 8 + T कोशिकाओं9,10में वृद्धि, जबकि tcr खत्म करने सह agonist pmhc के साथ इंटरेक्शन coagonist-मध्यस्थता सक्रियकरण10वृद्धि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा । हालांकि, एकल श्रृंखला mhc constructs का उपयोग कई सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, यह समय और श्रम-उपभोक्ता इस प्रयोगात्मक प्रणाली का उपयोग कर कई सह-agonist पेप्टाइड दृश्यों का परीक्षण करने के लिए है, के रूप में यह विभिन्न पेप्टाइड्स के साथ अनुसूचित जाति mhc एंकोडिंग कई plasmids की पीढ़ी शामिल है, और बाद में transfections और सेल छँटाई. पहले, हम मूरीन नल की कमी सेल लाइन RMA-एस माउस टी सेल सक्रियकरण8,9में कई सह agonist पेप्टाइड्स परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन इस दृष्टिकोण नल की कमी मानव T2 सेल लाइन10के साथ सफल नहीं था, सबसे अधिक संभावना नल की प्रस्तुति के कारण-स्वतंत्र पेप्टाइड्स४१. हमारे प्रयोगात्मक प्रणाली की एक और सीमा है कि सह-agonist pmhc टी सेल सक्रियण ट्रिगर करने के लिए आवश्यक की महत्वपूर्ण राशि का निर्धारण करने के प्रयोजन के लिए सह-agonist pmhc अणुओं की राशि में फेरबदल के लिए एक तेजी से विधि प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, टेट्रासाइक्लिन-प्रेरित प्रणाली का इस्तेमाल टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता को बदलकर एकल सेल स्तर पर एगोनिस्ट pmhc मात्रा के अनुमापन की अनुमति नहीं देता है, क्योंकि अलग टेट्रासाइक्लिन एकाग्रता एचएलए-ए2 सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात को बदल देती है, सेल के आधार पर एचएलए-A2 के स्तर के बजाय । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि हम वर्तमान में जांच कर रहे है समर्थित लिपिड bilayers४२का उपयोग करने के लिए है, पहले से मुरीन सीडी4 + टी सेल सक्रियण के दौरान सह-agonism की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया या मोती एगोनिस्ट pmhc की निश्चित राशि पेश सह-agonist pmhc की बदलती मात्रा की उपस्थिति । जब यूवी-क्लीवेबल पेप्टाइड प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया4,४३, इन वैकल्पिक प्रयोगात्मक प्रणालियों के साथ ही सह agonist pmhc के विभिन्न मात्रा में कई सह-agonist पेप्टाइड दृश्यों के तेजी से परीक्षण की अनुमति चाहिए .
अनुसूचित जाति mhc प्रौद्योगिकी भी मानव या murine सीडी 4 टी कोशिकाओं में सह-agonism की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है, के रूप में एकल श्रृंखला mhc वर्ग द्वितीय पेश अणुओं पूर्व निर्धारित पेप्टाइड्स सफलतापूर्वक स्तनधारी कोशिका सतहों४४पर व्यक्त किया गया है. इसके अलावा, एचएलए-ई जैसे गैर-शास्त्रीय एमएचसी अणुओं की जांच के लिए एससी एमएचसी प्रौद्योगिकी का उपयोग बढ़ाया जा सकता है । Sc hla-E से पहले वर्णित किया गया है, और इसकी अभिव्यक्ति मानव T सेल सक्रियण४५को बाधित करने के लिए दिखाया गया है । ब्याज की एक और गैर शास्त्रीय mhc अणु CD1 है, जो पेप्टाइड्स४६के बजाय लिपिड प्रस्तुत करता है । Sc ने CD1 हैवी चेन और β2-माइक्रोग्लोब्युलइन के साथ मिलकर सेल की सतह पर व्यक्त किया है और प्रासंगिक लिपिड लिगन्स४७को बाइंड करने के लिए दिखाया गया है । एकल श्रृंखला mhc प्रौद्योगिकी टी और nk सेल सक्रियण के दौरान आणविक बातचीत की जांच के लिए एक अनुसंधान उपकरण के रूप में महान क्षमता है.
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को सिंगापुर के स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अपने cbrg/0064/2014 के तहत n.r.j.g. को अपने R571-002-012-592 से स्पंद आयाम मॉडुलन तक, नेशनल रिसर्च फाउंडेशन अन्वेटरशिप R571-000-272-281 के तहत पी. ए. एम के द्वारा समर्थित किया गया । ., और एक सिंगापुर translational अनुसंधान द्वारा (स्टार) अन्वेषक पुरस्कार (nmrc/स्टार/013/2012) अटल बिहारी के लिए हम विशेषज्ञ सेल छंटाई के लिए NUS इम्यूनोलॉजी कार्यक्रम प्रवाह कोर सुविधा से डॉ पॉल hutchinson और श्री teo guo के लिए आभारी हैं । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलिय्याह चेन के लिए आभारी हैं ।
Aim-V (serum free media) | Gibco | 12055091 | |
blasticidin | Gibco | R21001 | |
Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit) | BD | 554714 | |
F12 | Gibco | 10565-018 | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH3007103 | |
geneticin | Gibco | 10131035 | |
GolgiPlug (Brefeldin A) | BD | 555029 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522 | |
hygromycin | Gibco | 10687010 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | L4144 | |
Opti-MEM (low serum media) | Bibco | 31985070 | |
10 X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
recombinant human IL2 | R&D Systems | 202-IL | |
recombinant human IL7 | R&D Systems | 207-IL | |
recombinant human IL15 | R&D Systems | 247-ILB | |
tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
T-REx CHO cell line | Thermo Fisher Scientific | R71807 | |
10 x Trypsin/EDTA | Gibco | 15400054 | |
Antibodies | |||
CD3 | BD | 347347 | Clone SK7, RRID:AB_400287 |
CD8α | BD | 563795 | Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501 |
CD107a | BD | 566261 | Clone H4A3, RRID:AB_2739639 |
HLA-A2 | eBioscience | 17-9876-41 | Clone BB7.2, RRID:AB_11151522 |
IFN-γ | eBioscience | 12-7319-41 | Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250 |