بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لبناء دائرة الثقافة الخلية مصممة للكشف عن خلايا لأنواع مختلفة من التحفيز الكهربائي، واستخدامها في علاج الخلايا الجذعية الوسيطة لتعزيز التمايز أوستيوجينيك.
Abstract
وقد استخدمت على نطاق واسع الخلايا الجذعية الوسيطة/stromal (MSCs) التئام العظام في الأنسجة الهندسة النهج. التحفيز الكهربائي (إستيم) قد ثبت لزيادة التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر وتعزيز العظام شفاء في إعدادات السريرية. هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم واستخدامها في علاج الفئران MSC المشتقة من نخاع العظام لتعزيز التمايز أوستيوجينيك. لقد وجدنا أن علاج MSCs مع إستيم لمدة 7 أيام يؤدي إلى زيادة كبيرة في التفريق بين أوستيوجينيك، والأهم من ذلك، يستمر هذا التأثير برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف إستيم (7 أيام). يمكن استخدام هذا النهج لتقشير MSCs مع إستيم لتعزيز التمايز أوستيوجينيك لتحسين نسيج العظام الهندسة نتائج العلاج، وهكذا، تساعدهم على تحقيق إمكاناتهم الكاملة العلاجية. وبالإضافة إلى هذا التطبيق، يمكن أيضا استخدام هذا إستيم خلية دائرة الثقافة والبروتوكول للتحقيق في السلوكيات خلية إستيم الحساسة الأخرى، مثل الهجرة والانتشار والمبرمج ومرفق السقالة.
Introduction
زيادة في الصدمات النفسية و/أو تشوهات العظام التي يسببها المرض يعالجون باستخدام تركيبات مختلفة من العلاج بالخلايا وتقنيات الطب التجديدي. MSCs هي الخلية المختارة في هذه العلاجات، بسبب نشاط osteogenic عالية نسبيا، والعزلة وكفاءتها التوسع، وسلامة1. لتحقيق أقصى قدر من النشاط أوستيوجينيك، وهكذا، تحسين فعاليتها العلاجية، أدخلت عدة أساليب للتلاعب MSCs قبل استخدامها في هذه العلاجات (كما استعرضها موني et al.2). أحد هذه الأساليب هو إستيم، التي أبدت تعزيز التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر3 وتعزيز العظام شفاء المجراة في4. وعلى الرغم من تزايد عدد الدراسات التي تركز على علاج MSCs مع إستيم، نظام أمثل لتحقيق أقصى قدر من التأثير برو osteogenic إستيم في لم تتحدد.
استخدام أساليب أخرى في المختبر باستخدام إستيم الملح الجسور مغمورة في الأجلين المتوسط والثقافة، الذي يفصل بين الخلايا من أقطاب معدنية5. وميزة هذا هو أن إيصال إستيم عبر الجسور الملح يزيل إدخال مشتقات كيميائية (مثلاً، التآكل من أقطاب معدنية) التي قد تكون سامة للخلايا. وعلى الرغم من هذه الميزة، الجسور الملح مرهقة للعمل مع، واستيم وهي إيصال تختلف عن التي تم تسليمها في النماذج الحية، مما يجعل من الصعب على الربط بين النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام هذين النظامين. الأجهزة التي تقدم إستيم عبر أقطاب معدنية أو الكربون ثابتة داخل الآبار ثقافة الخلية (كما استعرضها توباي هرنيك وكابلان6) أفضل محاكاة الأجهزة المستخدمة في فيفو؛ ومع ذلك، هذه الأجهزة صعبة لتنظيف/تعقيم بين الاستخدامات وعدد الخلايا التي يمكن دراستها بكل تجربة محدودة. لقد قمنا بتصميم قاعة إستيم المقدمة هنا على وجه التحديد لمعالجة أوجه القصور في هذه الأجهزة الأخرى. في حين كان معظم من تجربتنا باستخدام هذه الدائرة إستيم مع 2D والثقافات ثلاثية الأبعاد تحتوي على نخاع العظام والدهنية-الأنسجة-المستمدة من MSCs3،4، فائدة كبيرة من هذه الدائرة أن من تنوعاً ومع طفيفة نسبيا التغييرات، يمكن تكييفها لدراسة أنواع الخلايا الأخرى ضمن مجموعة متنوعة من الظروف المختلفة.
هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم؛ ثم، علينا أن نظهر استخدام MSCs معاملة مع أنظمة مختلفة من إستيم وقياس أثر على التمايز أوستيوجينيك. يتم تقييم التمايز osteogenic لجنة السلامة البحرية عن طريق ترسب الكالسيوم والنشاط الفوسفاتيز القلوية، وعلامة أوستيوجينيك التعبير الجيني. الأهم من ذلك، في الماضي التجارب التي تستخدم هذا الإعداد، لاحظنا أن تستمر هذه الآثار برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف العلاج إستيم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا بناء غرفة وأسلوب لعلاج الخلايا الجذعية الوسيطة مع إستيم التي ينتج عنها تعزيز التمايز أوستيوجينيك.
الإعداد إستيم قدم لا تتطلب معدات خاصة والمعرفة، ويمكن أن يؤديها الباحثين المبتدئين في مختبر علم الأحياء/الكيمياء حيوية لخلايا الجذعية قياسية. ومع ذلك، عند بناء وا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل جزئيا بمنحه بدء مؤسسة AO (ح ق-14-03) ومؤسسة فريدريتششيم (فريدريتششيم Stiftung) مقره في فرانكفورت، ألمانيا.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k’o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
