Konstruktion og brug af en elektrisk Stimulation kammer for at øge Osteogenic differentiering i mesenkymale stamceller/stromale celler In Vitro
Summary
Her præsenterer vi en protokol til opførelse af en celle kultur kammer designet til at eksponere celler til forskellige typer af elektrisk stimulation og dets anvendelse i behandling af mesenkymale stamceller for at forbedre osteogenic differentiering.
Abstract
Mesenkymale stamceller/stromale celler (MSCs) er blevet brugt flittigt til at fremme knogleheling i tissue engineering tilgange. Elektrisk stimulation (EStim) har påvist at øge MSC osteogenic differentiering in vitro- og fremme knogle heling i klinisk indstillinger. Beskriver her vi opførelsen af en EStim celle kultur kammeret og dets anvendelse i behandling af rotte knogle-marv-afledte MSC til at forbedre osteogenic differentiering. Vi fandt, at behandling af MSCs med EStim til 7 dage resulterer i en betydelig stigning i den osteogenic differentiering, og vigtigst, denne pro-osteogenic effekt fortsætter længe efter (7 dage) EStim afbrydes. Denne tilgang af forbehandling MSCs med EStim til at forbedre osteogenic differentiering kunne bruges til at optimere knoglevæv engineering behandlingsresultater og således hjælpe dem med at opnå deres fulde terapeutiske potentiale. Ud over dette program, kan denne EStim celle kultur kammer og protokollen også bruges til at undersøge andre EStim-følsomme celle adfærd, såsom migration, spredning, apoptose og stillads vedhæftet fil.
Introduction
En forøgelse af traumer og/eller sygdom-induceret knogledefekter bliver behandlet ved hjælp af forskellige kombinationer af celleterapi og regenerativ medicin teknologier. MSC’er er celle valg i sådanne behandlinger, på grund af deres relativt høje osteogenic aktivitet, isolation og ekspansion effektivitet og sikkerhed1. For at maksimere deres osteogenic aktivitet, og dermed optimere deres terapeutiske effektivitet, der er indført flere metoder til at manipulere MSCs forud for deres anvendelse i disse behandlinger (som anmelder af Mauney et al.2). En sådan metode er EStim, som har vist sig at forbedre MSC osteogenic differentiering i vitro3 og fremme knogle heling in vivo4. Trods det stigende antal undersøgelser med fokus på behandling af MSCs med EStim, endnu en optimal regime til at maksimere Estim’s pro-osteogenic effekt ikke defineres.
Andre in vitro-metoder, EStim udnytte salt broer neddykket i substratet, som adskiller celler fra metallisk elektroder5. Fordelen ved dette er, at levere EStim gennem salt broer eliminerer indførelsen af kemiske biprodukter (fx, korrosion i metalliske elektroder) der kan være cytotoksiske. Trods denne fordel, salt broer er besværlige at arbejde med og EStim de levere adskiller sig fra de leverede i in vivo modeller, hvilket gør det vanskeligt at korrelere resultater, der opnås ved brug af de to systemer. Opsætninger, der leverer EStim via metalliske eller carbon elektroder fast inde i celle kultur wells simulere (som anmelder af Hronik-Tupaj og Kaplan6) bedre enheder, der bruges i vivo; men disse enheder er vanskelige at rengøre/sterilisere mellem bruger og antallet af celler, der kan studeres pr. eksperiment er begrænset. Vi designede EStim salen præsenteres her specifikt for at løse begrænsningerne af disse andre opsætninger. Mens de fleste af vores erfaring med at bruge denne EStim afdeling har været med 2D og 3D kulturer indeholdende knoglemarv – og fedtholdigt-væv-afledt MSCs3,4, en stor fordel af salen er der det er alsidig, og med mindre relativt ændringer, kan tilpasses til at studere andre celletyper under en række forskellige betingelser.
Her beskriver vi opførelsen af en EStim celle kultur kammer; derefter, vi demonstrere brugen af behandling af MSCs med forskellige regimer EStim og måle den resulterende virkning på osteogenic differentiering. MSC osteogenic differentiering er vurderet via calcium deposition, alkalisk fosfataseaktivitet og osteogenic markør genekspression. Vigtigere, konstaterede i tidligere eksperimenter, bruges denne opsætning, vi, at disse pro-osteogenic virkninger persistere længe efter EStim behandlingen blev afbrudt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi opførelsen af et kammer og en metode til behandling af mesenkymale stamceller med EStim, der resulterer i øget osteogenic differentiering.
Opsætningen EStim præsenteret kræver ikke specialviden udstyr og kan udføres i en standard stamcelle biologi/biokemi laboratorium af yngre forskere. Når bygge og bruge EStim kammer, skal særlig forsigtig træffes i et par kritiske trin. Når du håndterer platin elektroderne, skal ekstra pleje tages som dette metal er meget formbart…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet i en del af en AO Foundation starttilskud (S-14-03 H) og Friedrichsheim-fonden (Stiftung Friedrichsheim) hjemsted i Frankfurt am Main, Tyskland.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
References
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k’o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
