Vi foreslår en standardisert protokoll betegner mobilnettet sammensetningen av sent murine aterosklerotisk lesjoner inkluderer systematisk dyr disseksjon, vev innebygging, skjæring, flekker og analyse av truncus arterier fra atheroprone glatt muskel celle avstamning sporing mus.
Atherosclerosis er fortsatt den ledende dødsårsaken som er over hele verden, og til tross for utallige prekliniske studier som beskriver lovende terapeutiske mål, romanen intervensjoner har vært unnvikende. Dette er sannsynlig skyldes, delvis, til en avhengighet av prekliniske forebygging modeller undersøker virkningene av genetisk manipulasjon eller farmakologiske behandlinger på aterosklerose utvikling i stedet for etablerte sykdommen. Resultatene av disse studiene er også ofte forvirrende på grunn av bruk av overfladiske lesjon analyser og manglende karakterisering av lesjon celle populasjoner. For å overvinne disse translasjonsforskning hekk, foreslår vi en økt avhengighet på tiltak som bruker undersøkelse av endringer i mobilnettet komposisjon ved en enkeltcelle nivå av immunofluorescent flekker og AC confocal mikroskopi. Dette beskriver vi en protokoll for å teste en antatte terapeutisk agent i murine intervensjon modell inkludert en systematisk tilnærming for dyr disseksjon, innebygging, skjæring, flekker og kvantifisering av truncus lesjoner. I tillegg på grunn av fenotypiske mangfoldet av celler i sent aterosklerotisk lesjoner beskriver vi viktigheten av å bruke celle-spesifikke, induserbart avstamning sporing musen systemer og hvordan dette kan utnyttes for upartiske karakteristikk av aterosklerotisk lesjon celle populasjoner. Sammen disse strategiene kan hjelpe vaskulær biologer mer nøyaktig modell terapeutisk intervensjon og analysere atherosclerotic sykdommer og vil forhåpentligvis føre til en høyere rate av suksess i kliniske forsøk.
Atherosclerosis er den ledende årsaken til sykelighet og dødelighet verden underliggende flertallet av coronary arterien sykdom, perifer arterien sykdommer og slag. Sent koronar aterosklerose kan føre til alvorlige komplikasjoner inkludert hjerteinfarkt brudd sto for nesten 16% av verdens befolkning dødelighet1,2. På grunn av dens ødeleggende innvirkning på folkehelsen, har betydelig innsats blitt gjort å dechiffrere mekanismer kjøring aterosklerose progresjon, samt for å utvikle nye strategier. Likevel, sannsynligheten av godkjenning (LOA) kliniske studier for hjerte-og karsykdommer er blant de laveste sammenlignet med andre kliniske felt (bare 8.7% for fase I)3. Dette kan forklares i del av mange hindringer at aterosklerose utgjør for effektiv narkotika utvikling inkludert nesten allestedsnærværende natur, klinisk lydløs fremdrift, og vesentlige sykdom heterogenitet. Videre kan suboptimal utformingen av prekliniske dyrestudier også gjøres rede for mangel på suksess i klinisk oversettelse. Spesielt mener vi det er nødvendig å implementere intervensjon studier mulig å undersøke effekten av strategier. Dessuten finnes det et kritisk behov for å utføre standardisert prosedyrer for lesjon analyser inkludert avanserte karakteristikk av sent aterosklerotisk lesjon mobilnettet sammensetning av skjebnen kartlegging og phenotyping.
Majoriteten av aterosklerose studier fokuserer på modeller av aterosklerose forebygging bestående av narkotika behandling eller genet manipulasjon (knockout eller knock-i) i friske unge mus, før sykdom Debutalder og progresjon. Disse studiene har avdekket en rekke gener og signalnettverk molekyler som spiller en rolle i aterosklerose utvikling. Men kunne de fleste av disse målene oversette til effektiv behandling i menneskelig. Det er faktisk vanskelig å ekstrapolere effekten terapi har på sunn ung mus til eldre pasienter med avansert aterosklerotisk lesjoner. Som sådan, gir gjennomføringen av intervensjonen studier i preklinisk eksperimentelle rørledningen sannsynlig et mer nøyaktig bilde av relevans og effekten av en ny terapeutisk. Er støttet av påfallende divergerende virkningene av hemme pro-inflammatoriske cytokin Interleukin-1β (IL-1β) når ansette en forebygging4,5,6 eller intervensjon strategi7. Forskjeller mellom forebygging og intervensjon studier tyder på at ulike cellulære prosesser oppstå i forskjellige faser av aterosklerose utvikling og understreker at forebygging studier er sannsynligvis nok til å modellere klinisk scenariet tilstrekkelig.
American Heart Association nylig publisert en vitenskapelig uttalelse detaljering anbefalinger for riktig eksperimentell design, fremgangsmåter for standardisering, analyse og rapportering av dyr aterosklerose studier8. Det fremhever fordelene og ulempene av dominerende teknikker som brukes i feltet. For eksempel utføres en ansikt Sudan IV farging av aorta ofte som en første lese-out. Men no ansikt Sudan IV flekker lipid program er en egnet metode for vurdering av globale plakk byrden, er det ikke kan skille tidlig stadium fet strek lesjoner fra mer avanserte sent lesjoner. Slik er tolkning av en ansikt flekker ofte uklare og overfladiske9. Forsiktig analyse av vev tverrsnitt morfologiske parametere båten leksjonen og lumen størrelse og kvantifisering av indekser lesjon stabilitet gir en mer nøyaktig forståelse av virkningen av et eksperiment.
Til slutt, menneskelige histopatologi studier har antydet at mobilnettet sammensetning er en bedre prediktor for ruptur enn lesjon, med lesjoner fattige i glatte muskelcellene (SMC) og rike i makrofager er mer utsatt for brudd10, 11. Disse observasjonene var basert på flekker for markører klassisk brukes til celle identifikasjon (dvs. ACTA2 for SMC og LGALS3 eller CD68 for makrofager). Uttrykket av disse markørene er imidlertid ikke strengt begrenset til en enkelt celle type i aterosklerotisk lesjoner på grunn av plastisitet av flere overleveringslinjer inkludert SMC, endotelceller og myeloide celler12. Spesielt var entydig identifikasjon av SMC innen aterosklerotisk lesjon praktisk talt umulig inntil det siste tiåret på grunn av for disse cellene til dedifferentiate og undertrykke deres slektslinje kundespesifikk markør gener (en prosess kalt fenotypiske bytte) i skadet eller syke fartøy13. Denne begrensningen i SMC identifikasjon har vært circumvented ved utviklingen av avstamning sporing7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. består av permanent merking SMC og deres avkom å spore deres skjebne og fenotypiske utviklingen under aterosklerose progresjon ved hjelp av en kombinasjon av uttrykk for grobunn recombinase drevet av SMC-spesifikke arrangører (dvs. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 og SM22α14,16) og aktivering av journalister (f.eks fluorescerende proteiner, β-galactosidase) [gjennomgått i Bentzon og Majesky 201827]. I en av de første studiene ansette SMC avstamning sporing utenfor embryogenesis innstilling, Speer et al.14 gitt bevis at SMC kan modulerer deres fenotypen og transdifferentiate til chondrogenic celler under vaskulær forkalkninger ved hjelp av en SM22α grobunn R26R LacZ avstamning sporing modell. Selv om disse studiene banebrytende SMC avstamning sporing, var de delvis tvetydig i at noen gitt ikke-SMC uttrykke SM22α i innstillingen av sykdommen vil merkes med reporteren. Denne begrensningen har blitt forbigått av utvikling og bruk av tamoxifen-induserbart grobunn ERT/LoxP tillater en timelig kontroll av cellen merking. Cellen merking skjer utelukkende i tamoxifen levering og vil være begrenset til cellen uttrykke celle spesifikk arrangøren kjøring Cre ERT uttrykk ved tamoxifen eksponering, unngå sporing av alternative celletyper aktivere grobunn i den innstilling av sykdomsprogresjon. For avstamning sporing av SMC i aterosklerose, tamoxifen-induserbart Myh11– grobunn/ERT2 transgene forbundet med fluorescerende journalister (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, konfetti20,22,23 for klonal ekspansjon studier) har vist en bemerkelsesverdig effektivitet og spesifisitet i SMC merking og har brukt til skjebnen kart SMC befolkninger i aterosklerotisk lesjoner i studier. Viktigere, disse studiene avslørte at: 1) 80% av SMC innen avansert aterosklerotisk lesjoner gjør ikke uttrykker alle konvensjonelle SMC markører (ACTA2, MYH11) i immunohistological analyse og derfor ville ha vært feilidentifisert uten avstamning sporing 17; 2) delsett av SMC express markører alternative celletyper inkludert macrophage markører eller mesenchymal stamceller markører16,17,19; og 3) SMC investere og fylle aterosklerotisk lesjonen ved oligoclonal ekspansjon og SMC kloner beholde plastisitet overgang til svært ulike befolkningsgrupper20,23. For å oppsummere, er det nå klart at glatte muskelcellene presentere et bemerkelsesverdig fenotypiske mangfold i aterosklerotisk lesjoner og kan ha gunstig eller ødeleggende roller på lesjon patogenesen avhengig av deres fenotypiske overganger. Disse funnene representerer en bemerkelsesverdig ny terapeutiske vei for målretting SMC athero-fremme fenotypiske overganger i sent åreforkalkning.
Her foreslår vi en standardisert protokoll for å analysere sent murine aterosklerotisk lesjoner inkludert systematisk metoder for dyr disseksjon, innebygging, skjæring, flekker og kvantifisering av truncus lesjoner. For å fastslå effekten av Interleukin-1β hemming på SMC skjebne og fenotype, brukte vi SMC avstamning sporing ApoE– / – mus matet en vestlig kosthold for 18 uker før ukentlige injeksjoner av en anti-IL1β antistoffer eller isotype-matchet IgG kontroll.
Til tross for tiår med forskning og tekniske fremskritt i å studere aterosklerose, har feltet en skuffende historie oversette vitenskapelige funn til klinisk behandling34,35. Dette fenomenet kan delvis forklares med avvik i dyremodeller og eksperimentell design lesjon analyser. Her beskriver vi en eksperimentell rørledningen som vi pleide å analysere mobilnettet sammensetningen i avansert aterosklerotisk lesjoner bruker avstamning sporing mus<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker senter for biologisk Imaging (støttet av NIH 1S10OD019973-01) ved University of Pittsburgh for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av støttes av vitenskapelige Development Grant 15SDG25860021 fra American Heart Association til D.G. R.A.B. ble støttet av NIH gi F30 HL136188.
16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
Peanut oil | Sigma | P2144 | |
Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Xylene | Fisher | X55K-4 | |
Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |