本文提出了一种结合高压冷冻和微波辅助样品处理两种样品处理技术的协议, 然后用聚焦离子束扫描电子显微镜 (FIB-SEM) 进行最小树脂包埋, 用于获取数据。这是用小鼠胫骨神经样本和线虫证明的。
所述样品制备技术旨在将聚焦离子束扫描电子显微镜 (FIB-SEM) 中的最佳超微结构保存质量与成像方式的最佳对比度结合起来, 该显微镜用于获得用于3D 重建和建模的顺序图像堆栈。高压冷冻 (HPF) 允许接近本机结构保存, 但随后的冻结替代往往不能提供足够的对比度, 特别是对于较大的样品, 这是在3D 所需的 SEM 中进行高质量成像所需的重建。因此, 在本协议中, 在冷冻替代后, 在室温下采取额外的对比步骤。虽然这些步骤是在微波中执行的, 但也可以遵循传统的工作台加工, 这需要更长的孵化时间。随后嵌入少量树脂, 可以在 FIB-SEM 内更快、更精确地进行定位和制备。该方案特别适用于需要高压冷冻制备以获得可靠的超微结构保存但在使用 FIB-SEM 进行体积成像的冷冻替代过程中没有获得足够对比度的样品。结合最小树脂嵌入, 该协议为获取高质量的卷数据提供了高效的工作流程。
高压冷冻是获得高质量超微结构保存的首选样品制备方法, 它比使用化学固定1的传统制备方法表现得更好。这种冷冻制备方法适用于髓鞘小鼠组织2等样品, 对霉菌菌3的使用有严格的要求。在冷冻取代和树脂包埋后, 这些样品通常通过透射电子显微镜 (TEM) 或电子层析成像 (ET) 进行分析。如果必须使用 FIB-SEM 或串行块面成像对更大的体积进行成像, 以实现高分辨率大规模3D 重建, 那么在我们的经验中, SEM 的正确成像往往会受到缺乏对比度的阻碍。在 FIB-SEM 中, 图像通常是通过检测主电子束的背散射电子来记录的。背散射电子的产率与样品中重金属的含量成正比。因此, 协议是专门为体积成像设计的, 目的是通过额外的重金属浸渍来增强对比度。这种方法以化学固定样品为基础, 并将四氧化二酸-四氧化亚胺-四-四氧化亚铵-四的组合应用于系列块面和聚焦离子束扫描电子显微镜.包括使用甲酰胺和吡咯烷醇6或铅天冬氨酸7在内的改性已成功应用于不同的成像技术。
这里提供的协议结合了 HPF 的冷冻制备和冷冻辅助处理, 以增强在室温下使用丙酮中的四氧化二硫醚的对比度。我们在小鼠的髓鞘质质胫骨和线虫上证明了这一点,它们代表了需要高压冷冻以进行高质量超微结构保存的样品。此外, 它还显示了在脱水和渗透后, 样品是如何嵌入尽可能少的树脂的。这种最小的树脂嵌入8可以更快地定位感兴趣的结构, 并减少在样品处理上花费的时间, 包括减少使用离子束暴露感兴趣区域所需的时间。在显微镜内进行进一步的样品制备步骤后, 不断对样品进行成像和铣削, 以获得一叠图像。对于3D 可视化, 图像处理软件 (IMOD) 用于重建数据集的某些部分。
我们的工作流程描述了如何将最适合的体积成像样品对比结果与 HPF 和冷冻替代的最佳超微结构保存相结合。这对于严格需要冷冻制备的样品非常有用。应用仅限于可由 HPF 制备的小样本。在不同性质的样品中, 如植物材料或微生物, 该协议需要调整。
该协议的开发是为了说明使用 FIB-SEM 进行串行块面成像的最佳保存和对比。因此, 我们选择采用冷冻固定, 然后使用冷冻替代和微波辅助处理染色后。因此, 该协议仅限于足够小的样品, 用于高压冻结。样品载体的尺寸与该技术可以适当冻结的样品尺寸相匹配, 确定了宽度为3至 6 mm、厚度 ~ 200 微米的尺寸限制。这与小鼠神经样本有关, 因为坐骨神经直径太大, 无法容纳确保适当冻结所需的0.2 毫米载体。因此, 建议仔细解剖较小的神经, 如胫骨神经或其他细神经, 如股神经。由于髓鞘对伸展运动敏感, 在解剖新鲜可行的神经时必须非常小心, 以避免处理文物。一般来说, 只有可行的样品才应用于电子显微镜研究。
微波辅助加工和最小树脂包埋是为了加快制备和靶向过程。采用改进的 OTO 方案4进行微波辅助处理, 用于室温化学固定。家用微波不会产生相同的结果, 因为微波没有均匀分布, 温度不受控制, 也没有真空可以应用。样品越小, 化学品的渗透度就越好;因此, 通过较小的样品获得了最佳的结果。为了避免过热对样品造成损害, 温度控制和应用所需的最低微波功率至关重要。如果没有微波可用, 可以在工作台上执行微波辅助加工步骤, 这将导致更长的加工时间。要直接瞄准 SEM 中的结构, 必须从样品顶部去除尽可能多的树脂。在记录数据集之后, 需要对原始数据进行后处理, 以减小文件大小并提高信噪比。现代体积成像技术产生大量数据。因此, 要以快速、充分的方式执行数据处理, 需要在工作站上使用足够的 RAM。对于对齐操作, 所需的 RAM 至少是数据集大小的两倍。
该协议已在小鼠的神经质胫骨和线虫上进行了测试。Hall 等人12使用了类似的增强步骤后, 他们冻结替代在长凳上准备线虫.对于斑马鱼等任何其他模型生物, 可能需要调整协议。一个可能的修改是改变冷冻替代鸡尾酒的成分, 例如增加用于对比度增强的水 18.此外, 冻结替代的持续时间必须适应样品, 并可根据快速冻结替代议定书19大大缩短。一种可能是应用搅拌来加速冻结替代过程20。在冷冻替代之后, 可以进行进一步的修改, 例如反复应用增强化学物质和四氧化二铬 21.在微波处理过程中, 温度、孵化时间和功率设置可以变化, 以优化相应样品的结果。
该协议表明, 这种增强可以与其他冷冻替代协议和不同类型的样品结合起来, 如12号馆描述的那样, 这些样品是在 FIB-SEM 中成像的, 也可以是由串行块面扫描电子显微镜成像的。这些成像技术需要增强的对比度, 这对于透射电子显微镜来说并不那么重要。
The authors have nothing to disclose.
FIB-SEM 和 a. s. (FIB-SEM 运营商的职位) 由卓越集群和德国气体科学研究中心纳米显微镜和大脑分子生理学 (CNMPB) 提供资金。我们感谢托马斯·穆勒-赖克特实验室提供了线虫的样品.我们感谢乌尔里希·韦克特参与这部电影。
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |