Forberedelse og immunfarvning af Myelinating Organotypic cerebellare skive kulturer
Summary
Her vil vi præsentere en metode til at forberede organotypic skive kulturer fra mus lillehjernen og myelinskeden farvning af Immunhistokemi egnet til at undersøge mekanismerne i myelination og remyelination i det centrale nervesystem.
Abstract
I nervesystemet er myelin en kompleks membran struktur genereret af myelinating glial celler, hvilket ensheathes axoner og letter hurtigt elektriske overledning. Myelin ændring har vist sig at forekomme i forskellige neurologiske sygdomme, hvor det er forbundet med funktionelle mangler. Her vi give en detaljeret beskrivelse af en ex vivo model bestående af mus organotypic cerebellare skiver, som kan opretholdes i kultur i flere uger og yderligere være mærket for at visualisere myelin.
Introduction
Neuroner er særdeles polariseret celler, der omfatter en somato-dendritiske rum, der modtager input fra sine omgivelser og et axon, som sikrer, at den generation og udbredelsen af elektriske impulser til andre celler. Hurtige formering og rettidig levering af oplysninger er afgørende for et velfungerende nervesystem. I hvirveldyr, er det lettere ved myelination, som giver mulighed for øget cytoskeletale overledning hastighed1. Myelin er en specialiseret struktur dannes af sammenpresset lag af plasma membran genereret af myelinating glia, nemlig oligodendrocytes i centralnervesystemet (CNS) og Schwann celler i det perifere nervesystem (PNS). Både i CNS og PNS, axoglial interaktioner drive dannelsen af specialiserede cytoskeletale domæner: noder af Ranvier og deres omgivende domæner, paranodes og juxtaparanodes2. De cytoskeletale segmenter isoleret af myelin, eller stængelled, suppleant med noder af Ranvier, som svarer til små unmyelinated domæner beriget med spænding-gated natrium kanaler (Nav). Høj koncentration og hurtig aktivering af Nav kanaler på noder af Ranvier tillade regenerering af handling potentialer, og sammen med de isolerende egenskaber af myelin skeder, sikre effektiv og hurtig saltatory overledning af den nerve impuls langs axon3.
Ud over sin rolle i accelererende nerve impuls overledning hastighed, giver myelinating glia metaboliske støtte til axon, bevare dens langsigtede integritet og deltage i dets overlevelse4,5. Derudover er det blevet klart i de seneste år at myelin dynamisk moduleres hele livet, således formentlig deltager i forordningen og plasticitet af forskellige nervesystem funktioner. Justeringer af fordeling, antal, længde og tykkelse af myelin skeder langs axoner kan således repræsenterer en roman fint tune forskellige netværk6,7,8. Derfor, den evolutionære erhvervelse af myelin er en central proces for sensoriske, motoriske og kognitive funktioner og den undertrykkelse af netbårne af samspillet mellem axoner og glia er i stigende grad betragtes som et bidrag til den udviklingsmæssige eller erhvervede neurologiske sygdomme9.
Myelin sammensætning er blevet karakteriseret, med det specifikke ved en høj andel af lipider (70%) i forhold til proteiner (30%) i modsætning til andre cellulære membraner10. Men i modsætning til myelin lipider, de fleste af myelin proteiner er specifikke for myelin, herunder myelin grundlæggende protein (MBPS), proteolipid protein (PLP), 2′, 3′-cyklisk nukleotid 3′-phosphodiesterase (CNP), myelin-associerede glycoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG), PMP-22 og P010. Forskellige histologiske metoder at plette myelin findes baseret på lipid sammensætning, såsom Luxol hurtigt blå11, Sudan Black B12, Bakers syre hematin metode13, samt sølvfarvning14. Ikke desto mindre mulighed disse metoder ikke altid for en passende kontrast og opløsning til at visualisere enkelte fibre. En alternativ fremgangsmåde til at registrere myelin er gennem Immunhistokemi rettet mod myelin proteiner. Forskellige antistoffer rettet mod myelin-specifikke antigener med en høj specificitet og kan bruges rutinemæssigt til at opdage myelinerede strukturer. Antigen-antistof interaktion kan afsløres yderligere, ved hjælp af en sekundær antistof koblet til en fluorophore rettet mod de primære antistof og visualiseret med passende Fluorescens mikroskopi. Her, beskriver vi en immunokemisk protokol for at plette myelin på ex vivo cerebellare skiver, en model, som giver mulighed for en god konservering af nervevæv arkitektur. Derudover organisation og størrelse af Purkinje celler (den eneste myelinerede neuron af lillehjernen) gør dem et klassisk model for elektrofysiologiske undersøgelser og de er ligeledes ideel til at udføre fast eller live imaging studier.
De cerebellare skiver er genereret fra P9-P10 mus, gangen svarer til den tidlige start af Purkinje celle myelination, en proces, der opnås for det meste af en uge ex vivo (6-7 dage in vitro DIV)15. Endvidere, denne model er tilpasset til at undersøge demyeliniserende lidelser som multipel sklerose (MS), som en omfattende demyelinering kan være fremkaldt i cerebellare skiver ved hjælp af myelinotoxic sammensatte lysophosphatidylcholine (eller lysolecithin, LPC), som er efterfulgt af en spontan remyelination16,17. Endogene remyelination finder sted fra to dage efter LPC fjernelse af næringssubstratet og er næsten komplet efterbehandling en uge.
Gennemførelsen af denne protokol tager ca 3 uger, herunder en halv dag til cerebellare skive kulturer forberedelse, en uge til at opnå fuldt myelinerede skiver, efterfulgt af 2 dage at nå toppen af demyelinering og endnu en uge for deres fulde remyelination. Derudover kan Immunhistokemi være afsluttet i 2 dage. Protokollen beskrevet her er tilpasset et standard kuld af 6 mus unger og tilpasses med hensyn til antallet af dyr, der anvendes til de planlagte eksperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, vi detalje en protokol til at generere en ex vivo model svarer til musen cerebellare organotypic skive kulturer, tilpasset fra tidligere publicerede metoder15,16,19 , og den efterfølgende myelin immunfarvning af disse præparater. Denne strategi tilbyder mulighed for at visualisere myelin komponenter med en høj opløsning i både sunde og patologiske stater.
Cerebellare organotypic skive kultur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon og Dr. Thomas Roux for værdifulde kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af INSERM, ICM, ARSEP tilskud R13123DD, ANR R17127DD (til e.kr.) og FRM fellowship, SPF20110421435 (til e.kr.), FDT20170437332 (til M.T.). Vi takker CELIS celle kultur facilitet og icm. Quant imaging platform.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
