Forberedelse og immunostai-Myelinating Organotypic lillehjernen skive kulturer
Summary
Her presenterer vi en metode for å forberede organotypic skive kulturer fra musen lillehjernen og myelin-skjeden farging av immunhistokjemi egnet for å undersøke mekanismer for myelination og remyelination i det sentrale nervesystemet.
Abstract
I nervesystemet er myelin et kompleks membran generert av myelinating glial celler, som ensheathes axons og muliggjør rask Elektrisk ledning. Myelin endring har vist oppstår i ulike nevrologiske sykdommer, hvor det er forbundet med funksjonell underskudd. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en ex vivo modell består av musen organotypic lillehjernen skiver, som kan vedlikeholdes i kultur for flere uker og ytterligere merkes for å visualisere myelin.
Introduction
Neurons er svært polarisert celler, som omfatter en somato-dendrittiske kupé som mottar inndata fra omgivelsene og en axon som sikrer generasjon og overføring av elektriske impulser til andre celler. Rask overføring og rettidig levering av informasjon er avgjørende for riktig funksjon av nervesystemet. I virveldyr, er det tilrettelagt av myelination, som gir økende axonal ledning hastighet1. Myelin er en spesialisert struktur av komprimerte lag av plasma membran generert av myelinating glia, nemlig oligodendrocytes i sentralnervesystemet (CNS) og Schwann celler i perifere nervesystemet (PNS). Både i CNS og PNS, axoglial vekselsvirkningene kjøre dannelsen av spesialiserte axonal domener: noder av Ranvier og deres omkringliggende domener, paranodes og juxtaparanodes2. Axonal segmentene isolert av myelin, eller internodes, alternativ med noder av Ranvier, som samsvarer med små unmyelinated domener beriket i spenning-gated natrium kanaler (Nav). Høy konsentrasjon og rask aktivering av Nav kanaler på noder i Ranvier tillate fornyelse av handlingen potensialer, og de isolerende egenskapene av myelin hylser, sikre effektiv og rask saltatory gjennomføring av den nerve impuls langs axon3.
I tillegg til sin rolle i akselererende ledning hastigheten av det nerven impulsen, gir myelinating glia metabolske støtte til axon, bevare integriteten langsiktig og delta i overlevelse4,5. Videre har det blitt klart i de senere årene at myelin dynamisk modulert gjennom livet, således antagelig deltar i regulering og plastisitet av ulike nervesystemet funksjoner. Justeringer av distribusjon, antall, lengde og tykkelse på myelin sheaths langs axons kan dermed representerer en ny måte å fininnstille ulike nettverk6,7,8. Derfor evolusjonære oppkjøpet av myelin er en viktig prosess for sensoriske, motoriske og kognitive funksjoner og forstyrrelsene av samspillet mellom axons og glia er stadig som bidrar til den utviklingsmessige eller ervervet nevrologiske sykdommer9.
Myelin sammensetning har vært preget med den bestemte funksjonen av en høy andel av lipider (70%) sammenlignet med proteiner (30%) i motsetning til andre mobilnettet membraner10. Men i motsetning til myelin lipider er de fleste av myelin proteiner spesifikke for myelin, inkludert myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), 2′, 3-sykliske nukleotid 3-fosfodiesterase (CNP), myelin-assosiert glykoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glykoprotein (MOG), PMP-22 og P010. Ulike histologiske metoder stain myelin finnes basert på komposisjonen lipid, som Luxol rask blå11, Sudan svart B12, Baker syre hematin metoden13, samt sølv flekker14. Likevel, disse er ikke alltid mulig for en tilstrekkelig kontrast og oppløsning til å visualisere personlige fiber. En alternativ tilnærming til oppdage myelin er gjennom immunohistochemistry rettet mot myelin proteiner. Ulike antistoffer målrette myelin-spesifikke antigener med en høy spesifisitet og kan brukes rutinemessig å oppdage myelinated strukturer. Antistoff-antigen samspillet kan bli ytterligere avdekket ved hjelp av en sekundær antistoff koplet til en fluorophore rettet mot primære antistoffer og visualisert med tilstrekkelig fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en talipes protokoll til stain myelin på ex vivo lillehjernen skiver, en modell som gir en god bevaring av nervøs vev arkitektur. I tillegg organisasjon og størrelsen på Purkinje celler (eneste myelinated Nevron av lillehjernen) gjøre dem en klassisk modell for elektrofysiologiske studier og egner seg like godt å utføre fast eller live-imaging studier.
Lillehjernen skiver genereres fra P9-P10 mus, gangen tilsvarer tidlig utbruddet av Purkinje celle myelination, en prosess som oppnås hovedsakelig ved en uke ex vivo (6-7 dager i vitro, DIV)15. Videre, denne modellen er tilpasset for å undersøke demyeliniserende lidelser som multippel sklerose (MS), som en omfattende demyelinisering kan bli indusert i lillehjernen skiver ved hjelp av myelinotoxic sammensatte lysophosphatidylcholine (eller lysolecithin, LPC), som etterfølges av en spontan remyelination16,17. Endogene remyelination foregår fra to dager etter LPC fjerning fra kultur medium og er nesten en uke innlegg behandling.
Fullføringen av denne protokollen tar approximatively 3 uker, inkludert en halv dag for lillehjernen skive kulturer forberedelse, en uke å få fullt myelinated skiver, etterfulgt av 2 dager å nå toppen av demyelinisering og en uke i sin helhet remyelination. I tillegg kan immunohistochemistry fullføres i 2 dager. Protokollen beskrevet her er tilpasset en standard søppel av 6 mus pups og må tilpasses om antall dyr som brukes for planlagte eksperimentet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her vi detalj en protokoll for å generere en ex vivo modell tilsvarer musen lillehjernen organotypic skive kulturer, tilpasset fra tidligere publiserte metoder15,16,19 og påfølgende myelin immunostaining av disse forberedelsene. Denne strategien tilbyr muligheten til å visualisere myelin komponenter med en både sunn og patologiske tilstander.
Lillehjernen organotypic skive kulturer tatt fra 10 da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon og Dr. Thomas Roux for verdifulle kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av INSERM, ICM, ARSEP tilskudd R13123DD, ANR R17127DD (å e.Kr.) og FRM fellesskap, SPF20110421435 (å e.Kr.), FDT20170437332 (til Mt). Vi takker CELIS celle kultur anlegget og icm. Quant tenkelig plattform.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture–a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
