Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke solubilize og rense flere eukaryote borate transportører med homologi til SLC4 transporter familien bruke gjær. Vi beskriver også en kjemisk cross-linking analysen for å vurdere renset homomeric proteiner for multimeric montering. Disse protokollene kan tilpasses for andre utfordrende membran proteiner.
Stoff transportør 4 (SLC4)-familie av proteiner kalles bikarbonat transportører og inkluderer arketypiske protein Anion Exchanger 1 (AE1, også kjent som Band 3), mest tallrike membran proteinet i røde blodceller. SLC4 familien er homologe med borate transportører, som har vært preget i planter og sopp. Det er fortsatt en stor teknisk utfordring å uttrykke og rense membran transport proteiner til homogenitet i mengder egnet for strukturelle eller funksjonelle studier. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for overuttrykte borate transportører Saccharomyces cerevisiae, isolering av gjær membraner, solubilization protein av vaskemiddel og rensing av borate transporter homologs fra S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaog Oryza sativa. Vi også gi deg en glutaraldehyde cross-linking eksperiment for å analysen multimerization av homomeric transportører. Våre generalisert prosedyrer kan brukes på alle tre proteiner og er optimalisert for effekt. Mange av strategiene utviklet her kan benyttes for å studere andre utfordrende membran proteiner.
Problemer å skaffe tilstrekkelige mengder renset membran proteiner er en kritisk flaskehals i jakten på strukturelle og funksjonelle studier av reseptorer, ionekanaler og transportører. Mange protokoller finnes for middels høy gjennomstrømming rørledninger skjermen og finne kandidat membran proteiner som uttrykker godt nok for å aktivere påfølgende i vitro studier1,2,3,4 . Vanligvis proteiner er merket med en N – eller C-terminalen grønne fluorescerende protein (GFP), og uttrykket nivåer overvåkes ved-gel fluorescens eller fluorescens-gjenkjenning størrelse utelukkelse kromatografi (FSEC)5. Disse aktiverer triaging membran protein kandidater til høy uttrykke proteiner, moderat eller lav uttrykke proteiner, eller proteiner som uttrykker dårlig eller ikke i det hele tatt. Denne tilnærmingen fungerer bra når eksperimentell design er å undersøke stort antall kandidat gener å velge hvilken protein uttrykker best. Men i noen tilfeller forutsetter en eksperimentell tilnærming på å studere en bestemt membran protein, som kan være utfordrende når den protein uttrykk nivåer er i området moderat eller lav. I tillegg, kan noen ganger i disse tilfellene uttrykk nivåer bare minimal økes ved å endre Konstruer via truncations, thermostabilizing mutasjoner eller codon optimalisering. Det er derfor noen ganger nødvendig å optimalisere membran protein uttrykk og rensing protokoller for membran proteiner som uttrykker bare moderat godt.
SLC4 familien av transportører inkluderer den bikarbonat transporter Anion Exchanger 1 (også kjent som Band 3), mest tallrike membran proteinet i røde blodceller6og en sentral pådriver for cellular respirasjon. SLC4 familien er homologe med borate transportører, som er avgjørende for planter og har vist seg å en lignende struktur til Anion Exchanger 1 og natrium-kombinert SLC4 transportører7,8,9 ,10. Her rapporterer vi optimalisert protein uttrykk og rensing protokoller bruker S. cerevisiae å rense tre forskjellige borate transportører i gjær og planter. Vi markere i detalj hovedtrinnene vi tok for å optimalisere avkastningen og effektiviteten av renselser å homogenitet. I tillegg rapportere vi en kjemisk cross-linking analysen bruker glutaraldehyde for å overvåke multimeric montering av disse transportører i sammenheng med en renset protein-vaskemiddel-lipid kompleks. Cross-linking eksperimentet kan hjelpe vurdere homolog og vaskemiddel egnethet ved å vurdere multimeric staten oligomeric transportører etter rensing.
Denne protokollen forutsetter at den ønskede transporter er blitt klonet i en 2 µ avledet plasmider under induserbart kontroll GAL1 uttrykk i S. cerevisiae. For disse prosedyrene, DNA ble brukt koding full lengde vill-type borate transportører Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12og Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . C-terminalen i hver konstruksjon er lagt med en 10-hans-tag og en trombin cleavage området settes inn mellom transporter og 10-hans-koden å aktivere fjerning hvis ønsket. Protokollen vil også anta at plasmider allerede blitt forvandlet til DSY-5 uttrykk belastningen av S. cerevisiae på komplett supplerende selektiv medier (CSM) mangler histidin.
Her har vi delt detaljert protokoller som resulterer i rensing å homogenitet av tre distinkte eukaryote borate transportører. Protokollene som presenteres her er avledet fra andre protokoller for uttrykket av integrert membran proteiner i S. cerevisiae1,14, og vår optimaliseringer resultatet både forbedret renhet og bedre avlinger. Parameterne optimalisert her inkluderer celle kultur vekst volumer og ganger, perle-juling lysis prosedyrer, buffer komposisjon under cellen lyse og protein rensing, mengden av vaskemiddel brukes per gram membran, metall ion identifisere i affinitet rensing, volum affinitet, og gjennomføringen av en cross-linking analysen vurdere homolog og vaskemiddel egnethet ved å vurdere multimeric staten oligomeric transportører. Protokollene er vellykket for flere SLC4 homologs fra anlegget og fungal arter. En begrensning av alle strategier for rensing av integrert membran proteiner er at det finnes ingen universell membran protein rensing metode som er garantert å fungere. Det er mulig at våre protokoller er mer sannsynlig å være vellykket for proteiner nærmere i sekvens identitet og struktur til SLC4 transportører, og dermed medlemmer av SLC4, SLC23 og SLC26 kan være lovende mål15. Likeledes den mer evolusjonært fjernt fra borate transportører en membran transporter kan være, jo mer sannsynlig protokollen må være annerledes, som ved å variere uttrykk systemet, vaskemiddel eller andre nøkkelparametere4.
Protokollen utnytter den vanligste affinity koden i protein rensing, hans-koden. Til tross for tilstedeværelsen av urenheter i første eluted fraksjoner, kombinasjoner av nikkel affinitet, omfattende vask og påfølgende SEC rensing resulterer i høyrenset protein. En 10-hans-koden gir den strengere imidazole vasker og dermed kan fjerne mer bakgrunn bindende proteiner enn kan fjernes i vask tillatt av 8-hans – eller 6-hans-tags. Våre valg for ren fraksjoner feile på høyre side av de fleste svært ren gel fraksjoner, som tilsvarer peak SEC fraksjoner. Siste protein gir kan økes ved pooling og konsentrere seg mer fraksjoner, men med bytteforholdet litt mindre ren protein. Metodene presenteres her aktivert rensing av AtBor1 som førte til fastsettelse av sitt krystall struktur7, rensing forskjeller kutte av hans-koden og utveksle transporter til en annen vaskemiddel å forbedre krystall Diffraksjon7.
Våre protokollen reiser viktige hensyn for valg av homologs og vaskemiddel til solubilize og renser dem. DDM er et vanlig førstevalg for vaskemiddel fordi det er relativt milde, ofte vellykket på solubilizing, og har vært brukt i strukturelle og funksjonelle studier av en rekke membran proteiner. Bestemme om et vaskemiddel er et dårlig valg for en membran, er en felles metode for evaluering om protein gir en enkelt monodisperse peak på et sekund chromatogram, ikke en stor topp i ugyldig volumet eller et polydisperse topper, som Angi misfolded eller ufrankert protein. En mer subtil vurdering er oppdratt av våre rensing av ScBor1. Det renser i store mengder og ser gunstig og monodisperse på et sekund chromatogram, noe som tyder på det kan være et attraktivt mål for strukturelle studier. Våre cross-linking analysen viser imidlertid at det er en monomer når renset. Det er mulig at ScBor1 kunne innfødt eksisterer som en monomer i cellen, indikerer studier at SLC4 transportører og deres homologs er sannsynlig å være dimers7,8,9,10. Vår utvikling til cross-linking analysen skjedde etter bandets og løse strukturen i AtBor1. Imidlertid hadde vi vært i stand til å vurdere ScBor1 med AtBor1 med cross-linking analysen, verdifull tid og forskning innsats kan ha blitt omadressert å jakten på AtBor1 i stedet for ScBor1, som til slutt ikke lyktes i krystallisering og Diffraksjon eksperimenter. Denne analysen kan dermed hjelpe forskerne å skille mellom homologs eller vaskemidler bruke når forfølge strukturelle studier for å prioritere forhold som protein opprettholder sin mistenkt innfødt konformasjon. Analysen kan i tillegg brukes til å undersøke hvilke aminosyrer er avgjørende for multimerization, for å finne aminosyre erstatninger som destabilisere multimerization grensesnittet og føre til forplikte monomerer. En slik tilnærming er brukt til å undersøke funksjonelle betydningen av homomeric montering membran transportører16,17,18.
En generell nytte av vår metode er at gjær har vist å aktivere uttrykk for mange utfordrende membran proteiner av forskjellige funksjon1. I tillegg fremme sin lave kostnader og vekst ganger sin tilgjengelighet for mange forskningsinnsats som kan være mindre i stand å bruke uttrykket strategier som krever vev kultur eller dyre vekst medier. Prosedyrene presenteres her er relativt billig og kan utføres i én uke som understreker muligheten for tilnærming. Implementering av disse protokollene kan hjelpe aktiverer strukturelle og funksjonelle studier av andre utfordrende membran proteiner.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av oppstart midler på Davidson College.
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
Imidazole | Acros | 12202 | |
Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |