Diese Studie zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) Produktion durch Aktivierung der FcγR zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, Änderungen in der antimikrobiellen und Redox signaling Funktion der Phagozyten in Reaktion auf Immunkomplexe, opsonized Mikroorganismen oder direkte FcγR Vernetzung zu beurteilen.
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Methodenartikel
Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von ROS-Produktion In Makrophagen als Reaktion auf FcγR Vernetzung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die oxidative oder respiratorische Burst wird verwendet, um den schnellen Verbrauch von Sauerstoff und Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beschreiben durch Phagozyten in Reaktion auf verschiedene Reize immun. ROS erzeugt während der Immunaktivierung übt starke antimikrobielle Aktivität vor allem durch die Fähigkeit von ROS, DNA und Proteine, beschädigen Tod von Mikroorganismen verursacht. ROS-Produktion mit Leichtigkeit und reproduzierbar messen ist notwendig, um den Beitrag der verschiedenen Wege und Moleküle zu diesem Mechanismus der Host Verteidigung zu bewerten. In diesem Papier wir zeigen die Verwendung von fluoreszierenden Sonden und flow Cytometry um ROS-Produktion zu erkennen. Obwohl weit verbreitet, wird Fluoreszenz Messung von ROS notorisch problematisch, vor allem im Hinblick auf die Messung von ROS durch spezifische und nicht Mitogene Reize induziert. Wir präsentieren Ihnen eine detaillierte Methode um ROS erzeugt durch spezifische FcγR Stimulation beginnend mit Makrophagen-Generierung, Grundierung, Färbung, FcγR Vernetzung und endend mit durchflusszytometrischen Analyse zu erkennen.
Einleitung
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind reaktive Moleküle oder freie Radikale, die Nebenprodukte der aeroben Atmung (rezensiert in 1). Dazu gehören die Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid, Wasserstoffperoxid, Hydroxyl-radikal und Hydroxyl-Ionen, unter anderem. Unter normalen physiologischen Bedingungen ROS entstehen vor allem durch die Mitochondrien und Nicotinamid Adenin Dinucleotide Phosphat (NADPH) Oxidasen und werden schnell durch verschiedene Enzyme und Proteine wie Superoxid-Dismutase und Glutathion entgiftet. Eine übertriebene Produktion von ROS oder ein Defekt in der Fähigkeit, ROS entfernen führt zu oxidativem Stress, wobei reaktive Saue....
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Protokoll
Das Protokoll für den Umgang mit Tieren wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss (IACUC) der University of Central Florida genehmigt.
1. Generation des Knochenmarks abgeleiteten Makrophagen (BMDMs)
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Nährmedien Vorbereitung
- Bereiten Sie D10F base Medien: zu Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
Hinweis: Obwohl es am besten, frischen D10F Medien nutzen, können D10F base Medien bis zu zwei Wochen im V....
- Bereiten Sie D10F base Medien: zu Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
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Ergebnisse
Unter Verwendung des Protokolls in umrissen, präsentieren wir Ihnen repräsentative Daten demonstrieren Fluss durchflusszytometrischen Erkennung der ROS-Produktion durch Stimulation der WT C57BL/6J BMDMs durch die FcγR. Wie erwartet, wir beobachten nur minimale Änderungen im FL1 oder FL2 Fluoreszenz über Hintergrund-Niveaus in unstimulierte Zellen (Abb. 3A, "gebeizt, unstimulierte" Vs "ungefärbten, unstimulierte" Dot Grundstücke zu vergleichen). Wir beobachten eine deutliche Steigerung FL1- u.......
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Diskussion
RLKV2-DA und DHE-basierte Erkennung von ROS ist eine weit verbreitete Technik14,15. Einfache Bedienung und die Anpassungsfähigkeit der diese ROS-Sonden für kinetische Mikrotestplatte Formate hat Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow durchflusszytometrischen Analyse zu ihrer Beliebtheit beigetragen. Jedoch in unseren Studien FcγR-vermittelten Makrophagen Funktionen schien es kein Standardprotokoll für die Durchführung dieses Assays für durchflusszytometrisc.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Danksagungen
Die Autoren möchten anderen Mitgliedern des Tigno-Aranjuez Labor einschließlich Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy und Roopin Singh für ihre Hilfe im Labor Unterhalt und Maus Kolonie Wartung danken. Unterstützung für diese Forschung lieferte Grant R00 HL122365 und Startkapital J.T.T-a.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Forschung | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Ratte IgG2b, κ Isotyp Ctrl Antikörper | BioLegend | 400626 | |
| Anti-Maus CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-Maus F4/80 Antikörper, konjugiert an Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-Maus F4/80 Antikörper, konjugiert an FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-Maus/Mensch CD11b Antikörperkonjugiert an Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| Beta-Mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Rinderserumalbumin (BSA) FraktionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson | Labs Best.-Nr. 000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molekulare Sonden | C6827 | Kann ein Ersatz für das Reagenz zur Detektion oxidativen Stresses im Enzo-Kit |
| sein Dihydroethidium (DHE) | Molekulare Sonden | D11347 | Kann ein Ersatz für das Reagenz zur Erkennung von Superoxiden im Enzo-Kit |
| sein DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM ohne Phenolrot | Gibco | 31053-028 | |
| DMF wasserfrei | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Ratte IgG2a, κ Isotyp Ctrl Antikörper | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC Zellen | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| Maus IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-Cystein | EMD Milipore | 106425 | Kann ein Ersatz für den ROS-Inhibitor/Scavenger im Enzo-Kit sein |
| Novocyte-Durchflusszytometer mit Autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS-Induktor) | Cayman chemisches | 10009594 | Kann ein Ersatz für den Induktor im Enzo-Kit sein |
| ROS-ID Gesamt-ROS/Superoxid-Nachweiskit | ENZO ENZ-51010 | ||
| Natriumpyruvat (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-056 |
Referenzen
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462....
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Nachdrucke und Genehmigungen
