Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici
Summary
Descriviamo un modello di epatite traslazionale di immunizzazione in vivo nei topi BALB / c che può essere utilizzato per studiare la patogenesi dell’epatite autoimmune indotta da farmaci, comprese le differenze di sesso osservate in questa malattia. Descriveremo come questo modello dimostra analisi riproducibili utilizzando tecniche sperimentali in vivo e in vitro.
Abstract
L’epatite autoimmune indotta da farmaci (DIH) è il più comune processo di ipersensibilizzazione indotta da farmaci epatici osservato in circa il 9-12% dei pazienti con epatite autoimmune. La stragrande maggioranza dei pazienti con DIH sono donne. I meccanismi alla base di queste differenze sessuali nella prevalenza non sono chiari a causa della scarsità di modelli animali che imitano la malattia umana. Anche così, i meccanismi sottostanti sono ampiamente ritenuti associati agli aplotipi dell’antigene leucocitario umano e agli ormoni sessuali. Al contrario, utilizzando un modello murino DIH, abbiamo scoperto che le cellule T CD4+ avviate da IL-4 dirette contro un epitopo del citocromo P450 2E1 inducono l’afflusso di neutrofili, macrofagi e mastociti nel fegato di topi BALB/ c femminili. Utilizzando questo modello, abbiamo anche dimostrato che le cellule T regolatorie FoxP3+ indotte da IL-33 conferiscono protezione contro il DIH nei topi femmina e maschio. Questo modello di DIH è indotto immunizzando i topi con un epitopo del CYP2E1 che è stato alterato covalentemente con un metabolita del farmaco che è stato associato al DIH. Questo epitopo è riconosciuto dai pazienti con DIH. Il nostro metodo induce epatite e autoanticorpi robusti e riproducibili che possono essere utilizzati per studiare la patogenesi della DIH. Mentre gli studi in vivo possono causare dolore e angoscia indebiti nei topi se eseguiti in modo improprio, il vantaggio di un modello in vivo è la capacità di valutare la patogenesi della malattia in un gran numero di topi. Inoltre, gli effetti biologici delle proteine epatiche alterate possono essere studiati utilizzando procedure invasive. L’aggiunta di studi in vitro al disegno sperimentale consente una rapida ripetizione e analisi meccanicistica a livello cellulare. Pertanto, dimostreremo il nostro protocollo modello e come può essere utilizzato per studiare i meccanismi in vivo e in vitro del DIH.
Introduction
Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un modello murino di epatite autoimmune indotta da farmaci che si sviluppa in vivo e dimostrare come può essere utilizzato per indagare le basi molecolari, immunologiche e genetiche di questa malattia. L’obiettivo a lungo termine dei nostri studi è quello di scoprire i meccanismi responsabili dello sviluppo di infiammazione e lesioni epatiche croniche studiando la DIH in pazienti sensibili. Le malattie del fegato e la cirrosi costituiscono la sesta causa più comune di morte negli adulti di età compresa tra 25 e 64 anni. La DILI idiosincratica, a volte indicata come epatite autoimmune indotta da farmaci (DIH), è la terza causa più comune di insufficienza epatica acuta negli Stati Uniti. La DIH è il più comune processo di ipersensibilizzazione indotta da farmaci epatici osservato in circa il 9-12% dei pazienti con epatiteautoimmune 1. La stragrande maggioranza dei pazienti con DIH sono donne 2,3,4. Un tipo di DIH si sviluppa in individui sensibili dopo la somministrazione di anestetici volatili alogenati come isoflurano, sevoflurano, desflurano o alotano. Questi anestetici si legano covalentemente alle proteine del fegato con prodotti reattivi del loro metabolismo, creando così nuovi autoantigeni in grado di suscitare risposte allergiche o autoimmuni5.
Lo studio dei meccanismi patogenetici coinvolti nello sviluppo dell’anestetico e di qualsiasi forma di DIH è stato precedentemente ostacolato dalla mancanza di un modello animale che imiti da vicino l’induzione della malattia umana. Abbiamo sviluppato un modello murino sperimentale di DIH con caratteristiche simili al DILI immuno-mediato nei pazienti. L’epatite è indotta dall’immunizzazione con uno dei due autoantigeni che sono stati modificati covalentemente dal metabolita del cloruro di trifluoroacetile (TFA) che si forma in seguito al metabolismo ossidativo dell’anestetico dall’enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantigene è la frazione epatica citosolica S100 epatica, che è una miscela di diverse proteine6, e il secondo autoantigene è un epitopo del CYP2E1 che viene riconosciuto dai sieri di pazienti con DILI7 immuno-mediato anestetico. Utilizzando topi BALB/c, che sono relativamente resistenti all’epatite autoimmune sperimentale, distinguiamo il nostro modello dal modello di immunizzazione indotta da S100 dell’epatite autoimmune nei topi C57Bl/ 6J8.
A causa delle sue diverse presentazioni cliniche, DIH è difficile da studiare nei pazienti. Modelli sperimentali traslazionali offrono la capacità di valutare la patogenesi della malattia in vivo e in vitro. Allo stato attuale, non ci sono altri metodi alternativi per indurre DIH che esaminano completamente in vivo o in vitro risposte immunitarie adattive o innate senza l’uso di animali. Inoltre, poiché la trifluoroacetilazione di S-100 o dell’epitopo cyp2E1 non sembra produrre un immunogeno irritante e stiamo inducendo DIH mediante immunizzazione con proteine alterate da TFA, questi animali non riceveranno etere, alcun anestetico alogenato, barbiturico o alcol prima dell’immunizzazione o di altre procedure, considerando che questi agenti possono alterare i parametri che stiamo studiando. Anche così, abbiamo ridotto il nostro utilizzo del mouse utilizzando la simulazione al computer per confermare le preferenze di legame del nostro epitopoCYP2E1 9 scoperto e abbiamo rispecchiato il DIH umano che implica il sesso femminile dimostrando che i topi BALB / c femminili sviluppano un DIH10 più grave.
Nonostante le diverse presentazioni di DIH nei pazienti e le sfide nello studio della malattia clinica, la modifica post-traduzionale delle proteine native da parte dei metaboliti reattivi dei farmaci è un meccanismo chiave accettato nella patogenesi DIH che segue gli anestetici alogenati11. Gli investigatori accettano anche che il CYP2E1 è un autoantigene importante in questo processo12,13. Il ruolo delle cellule CD4+T interleuchinate (IL)-upregolate che riconoscono un CYP2E1 post-traduzionalmente modificato e altre proteine epatiche è un iniziatore accettato del DIH anestetico attirando neutrofili, eosinofili e mastociti nel fegato14, e questo meccanismo è stato confermato in molte forme di DIH 15,16. Le cellule CD4+CD25+T indotte che esprimono FoxP3 (Tregs) riducono la gravità del DIH e le carenze relative di queste cellule nella milza peggiorano il DIH 10,7. Pertanto, la maggior parte dei progressi nella comprensione del DIH sono stati resi possibili utilizzando modelli murini in vivo per valutare i meccanismi genetici, metabolici e immunologici del DIH sia in vivo che in vitro.
Poiché noi e altri ricercatori abbiamo scoperto ruoli per IL-4, neutrofili ed eosinofili nell’inizio della DIH utilizzando diversi modelli murini, riteniamo che questa osservazione supporti la nostra tesi che, indipendentemente dal modello DIH utilizzato, l’epatite e le lesioni sono indotte da IL-4. La forza del nostro protocollo risiede nell’utilizzo della metodologia in vivo, sia maschi che femmine, e nella ripetizione di istologia, saggi di proliferazione delle cellule T CD4 + e citochine. Il punto di forza del nostro uso di studi in vitro è che riducono il numero di topi necessari fornendo al contempo la metodologia per isolare le interazioni cellulari che guidano il DIH. Raccomandiamo l’uso di topi maschi e femmine perché questo riduce la possibilità di pregiudizi inconsci nell’interpretazione dei risultati e rafforza il potenziale di traduzione dei nostri studi poiché l’incidenza, la prevalenza e la gravità della DIH sono più elevate nelle donne17. Raccomandiamo che i topi siano ottenuti da un unico fornitore; tuttavia, se ciò non è possibile, ottenere controlli di cucciolata o topi selvatici dallo stesso fornitore dei topi geneticamente modificati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La forza di questo protocollo risiede nella sua riproducibilità; quindi, è fondamentale aderire ai passaggi suggeriti. La formulazione dell’immunogeno può essere una barriera per alcuni; tuttavia, abbiamo riprodotto il nostro modello utilizzando l’epitopo descritto nel nostro documento, che elimina la necessità di isolare la frazione S100 del fegato. È probabile che ulteriori epitopi o proteine possano essere alterati e indurre l’epatite dopo le vaccinazioni; tuttavia, descriviamo quelle proteine che abbiamo usato c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il Dr. Njoku vorrebbe ringraziare il Dr. Noel R. Rose, MD PhD, per la sua guida e le discussioni approfondite che hanno portato alla formulazione di questo modello.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
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