माउस Cochlea के विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों में रिबन Synapses के Morphological और कार्यात्मक मूल्यांकन
Summary
इस पांडुलिपि सामान्य चूहों में रिबन synapses के रूपात्मक विशेषताओं और कार्यात्मक स्थिति के मूल्यांकन के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. वर्तमान मॉडल शोर प्रेरित और उम्र से संबंधित cochlear synaptopathy-प्रतिबंधित मॉडल के लिए भी उपयुक्त है. पिछले माउस अध्ययन के सहसंबंधी परिणाम भी चर्चा कर रहे हैं.
Abstract
Cochlear भीतरी बाल कोशिकाओं (IHCs) ध्वनिक संकेतों को सर्पिल गुच्छिका न्यूरॉन्स के लिए संचारित (SGNs) रिबन synapses के माध्यम से. कई प्रयोगात्मक अध्ययनों से संकेत दिया है कि बाल सेल synapses sensorineural सुनवाई हानि (SNHL) में प्रारंभिक लक्ष्य हो सकता है. इस तरह के अध्ययनों से कोकलियर “सिन्पैटोपैथी” की अवधारणा का प्रस्ताव किया गया है, जो रिबन synapse संख्या, संरचना, या समारोह में परिवर्तन को संदर्भित करता है जिसके परिणामस्वरूप आईएचसी और एसजीएन के बीच असामान्य synaptic संचरण होता है। जबकि cochlear synaptopathy अपरिवर्तनीय है, यह सुनवाई सीमा को प्रभावित नहीं करता है. शोर प्रेरित प्रयोगात्मक मॉडल में, चयन आवृत्ति क्षेत्रों में IHC synapses को प्रतिबंधित क्षति पर्यावरणकारक है कि विशेष रूप से synaptopathy के कारण की पहचान करने के लिए कार्यरत है, साथ ही इस भीतरी कान परेशान करने के शारीरिक परिणाम सर्किट. यहाँ, हम वयस्क चूहों में एक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र में cochlear synaptic आकृति विज्ञान और समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों के cochlear स्थानीयकरण cochleogram डेटा के साथ संयोजन के रूप में जगह आवृत्ति नक्शे का उपयोग किया जाता है, जिसके बाद रिबन synapses के रूपात्मक विशेषताओं synaptic के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं इम्यूनोस्टेनिंग. रिबन synapses के कार्यात्मक स्थिति तो श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (एबीआर) लहर मैं के आयाम के आधार पर निर्धारित किया जाता है. वर्तमान रिपोर्ट दर्शाता है कि इस दृष्टिकोण रोगजनन और cochlea, जो उपन्यास चिकित्सकीय हस्तक्षेप के विकास में सहायता कर सकते हैं में synaptic रोग के तंत्र की हमारी समझ को गहरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
लगभग 20$u20120,000 हर्ट्ज की सीमा में आवृत्ति को मनुष्यों द्वारा श्रवण उत्तेजनाओं के रूप में माना जा सकता है। मानव सुनवाई सामान्य रूप से 1,000 हर्ट्ज के पास सबसे संवेदनशील है, जहां औसत ध्वनि दबाव स्तर युवा वयस्कों में 20 $Pa है (यानी, ध्वनि दबाव स्तर के 0 डेसीबल [डीबी एसपीएल]). कुछ रोगकी स्थितियों में, सुनवाई हानि विशिष्ट आवृत्तियों के लिए प्रतिबंधित है. उदाहरण के लिए, शोर प्रेरित सुनवाई हानि (NIHL) के प्रारंभिक चरणों में, एक “पायदान” (यानी, सुनवाई दहलीज ऊंचाई) audiogram में 4 kHz1पर मनाया जा सकता है. स्तनधारी कोचलर विभाजन के साथ, कठोरता और द्रव्यमान के इसके वर्गीकरण एक घातीय आवृत्ति मानचित्र का उत्पादन करते हैं, जिसमें शीर्ष2पर कोकलेया और कम आवृत्ति का पता लगाने के आधार पर उच्च आवृत्ति ध्वनि का पता लगाने के साथ। वास्तव में, वहाँ बेसिलर झिल्ली के साथ एक cochlear जगह आवृत्ति नक्शा है, जो tonotopic संगठन2,3के रूप में जाना जाता है के लिए अग्रणी. बेसिलर झिल्ली पर प्रत्येक दिए गए स्थान में केवल एक विशेष ध्वनि आवृत्ति के लिए उच्चतम संवेदनशीलता होती है, जिसे आमतौर पर विशेषता आवृत्ति3,4कहा जाता है, हालांकि अन्य आवृत्तियों की प्रतिक्रियाओं को भी देखा जा सकता है।
तारीख करने के लिए, विभिन्न माउस मॉडल श्रवण प्रणाली में सामान्य समारोह, रोग प्रक्रियाओं, और चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है. माउस cochlea में शारीरिक मापदंडों का सटीक ज्ञान सुनवाई हानि के ऐसे अध्ययन ों के लिए एक शर्त है. माउस cochlea शारीरिक रूप से शीर्ष में विभाजित है, मध्य, और बेसल बदल जाता है, जो विभिन्न आवृत्ति क्षेत्रों के अनुरूप. कोचला में अपने इसी परिधीय आंतरिक अंत:प्रवर्तक स्थलों का विश्लेषण करने के लिए कोकलियर नाभिक में श्रवण तंत्रिका एफ़लेंटकोस का लेबल लगाकर, मेलर एट अल. विवो5में सामान्य माउस में कोकलियर स्थान आवृत्ति मानचित्र स्थापित करने में सफल रहा। के अंतराल में 7.2-61.8 kHz, जो के बीच पदों से मेल खाती है 90% और 10% बेसिलर झिल्ली की पूरी लंबाई के, माउस cochlear जगह आवृत्ति नक्शा एक सरल रैखिक प्रतिगमन समारोह द्वारा वर्णित किया जा सकता है, के बीच एक संबंध का सुझाव कोकलियर आधार से सामान्यीकृत दूरी तथा विशिष्ट आवृत्ति5 के लघुगणक । प्रयोगशाला चूहों में, जगह आवृत्ति नक्शा विशिष्ट आवृत्ति पर्वतमाला और cochleograms के भीतर सुनवाई दहलीज के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बेसिलर झिल्ली के साथ रिश्तेदार क्षेत्रों में लापता बाल कोशिकाओं की संख्या दिखा6. महत्वपूर्ण बात, जगह आवृत्ति नक्शा कम से कम संरचनात्मक क्षति की जांच के लिए एक स्थिति प्रणाली प्रदान करता है, इस तरह के परिधीय श्रवण आघात के साथ चूहों में विशिष्ट cochlear आवृत्ति स्थानों पर बाल कोशिकाओं के रिबन synapses को नुकसान के रूप में7 ,8.
स्तनधारी cochlea में, रिबन synapses एक presynaptic रिबन के शामिल हैं, एक इलेक्ट्रॉन घने प्रक्षेपण कि iHC के भीतर ग्लूटामेट युक्त रिलीज के लिए तैयार synaptic vesicles के एक हेलो tethers, और SGN के तंत्रिका टर्मिनल पर एक postsynaptic घनत्व ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के साथ9| कोचलर ध्वनि रूपांतरण के दौरान, बाल कोशिका बंडल के विक्षेपण का विक्षेपण आईएचसी विध्रुवण में होता है, जो आईएचसी से पोस्टिनैप्टिक अपर्णा टर्मिनलों पर ग्लूटामेट रिलीज की ओर जाता है, जिससे श्रवण पथ को सक्रिय किया जाता है। इस मार्ग के सक्रियण ध्वनि प्रेरित यांत्रिक संकेतों के रूपांतरण की ओर जाता है एसजीएन10में एक दर कोड में. दरअसल, IHC रिबन synapse उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ हर्ट्ज के सैकड़ों की दरों पर indefatigable ध्वनि संचरण के लिए अत्यधिक विशिष्ट है, और ध्वनि एन्कोडिंग के presynaptic तंत्र के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि रिबन synapses वयस्क माउस cochlea11,12 में विभिन्न आवृत्ति क्षेत्रों में आकार और संख्या में काफी भिन्नता है ,12, संभावना के लिए विशेष ध्वनि कोडिंग के लिए संरचनात्मक अनुकूलन को दर्शाती है अस्तित्व की जरूरत है. हाल ही में, प्रयोगात्मक पशु अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि cochlear synaptopathy सुनवाई हानि के कई रूपों के लिए योगदान देता है, शोर प्रेरित सुनवाई हानि सहित, उम्र से संबंधित सुनवाई हानि, और वंशानुगत सुनवाई हानि13, 14.इस प्रकार, विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्रों में synaptic संख्या, संरचना, और समारोह में सहसंबद्ध परिवर्तन की पहचान करने के लिए तरीकों को तेजी से श्रवण विकास और आंतरिक कान रोग के अध्ययन में नियोजित किया गया है, के माध्यम से उत्पन्न मॉडल का उपयोग आनुवंशिक या पर्यावरणीय चरों का प्रायोगिक हेरफेर15,16,17.
वर्तमान रिपोर्ट में, हम वयस्क चूहों में बेसिलर झिल्ली के एक विशिष्ट आवृत्ति क्षेत्र में synaptic संख्या, संरचना, और समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। Cochlear आवृत्ति स्थानीयकरण एक cochleogram के साथ संयोजन में एक दिया जगह आवृत्ति नक्शे का उपयोग किया जाता है. कोकलियर रिबन synapses के सामान्य रूपात्मक विशेषताओं presynaptic और postsynaptic इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं। कोकलियर रिबन synapses के कार्यात्मक स्थिति ABR लहर मैं के suprathreshold आयाम के आधार पर निर्धारित किया जाता है. मामूली परिवर्तन के साथ, इस प्रोटोकॉल चूहों, गिनी सूअरों, और gerbils सहित अन्य पशु मॉडल में शारीरिक या रोग की स्थिति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि cochlear synaptopathy पहले एक अस्थायी दहलीज बदलाव के साथ वयस्क चूहों में विशेषता थी (टीटीएस) द्वारा प्रेरित 8 u201216 kHz सप्तक बैंड शोर पर 100 डीबी SPL के लिए 2 ज31, शोधकर्ताओं ने तेजी से विभिन्न में synaptopathy के प्रभाव क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81770997, 81771016, 81830030) द्वारा समर्थित किया गया था; बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन और बीजिंग शिक्षा समिति के संयुक्त वित्त पोषण परियोजना (K$201810025040); बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (7174291); और चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
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