Morfologisk och funktionell utvärdering av band synapser vid specifika frekvensområden i Mouse cochlea
Summary
Detta manuskript beskriver ett experimentellt protokoll för att utvärdera morfologiska egenskaper och funktionell status för band synapser i normala möss. Den nuvarande modellen är också lämplig för buller-inducerad och åldersrelaterade Cochlear synaptopati-begränsade modeller. De relativa resultaten av tidigare mus studier diskuteras också.
Abstract
Cochlear inre hårceller (IHCs) överföra akustiska signaler till spiral ganglion neuroner (SGNs) genom band synapser. Flera experimentella studier har indikerat att hår cells synapser kan vara de initiala målen i sensorineural nedsättning hörselnedsättning (SNHL). Sådana studier har föreslagit begreppet Cochlear “synaptopati”, som hänvisar till förändringar i band synaps antal, struktur, eller funktion som resulterar i onormal synaptisk transmission mellan ihcs och Sgns. Medan Cochlear synaptopati är oåterkallelig, det påverkar inte hörsel tröskeln. I bullerinducerade experimentella modeller används begränsade skador på IHC-synapser i utvalda frekvensområden för att identifiera de miljöfaktorer som specifikt orsakar synaptopati, samt de fysiologiska konsekvenserna av att störa detta inneröra Krets. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera cochleaimsynaptisk morfologi och funktion vid ett specifikt frekvensområde hos vuxna möss. I detta protokoll utförs Cochlear lokalisering av specifika frekvensområden med hjälp av plats frekvens kartor tillsammans med cochleogramdata, varefter de morfologiska egenskaperna hos band synapser utvärderas via synaptiska immun. Den funktionella status av band synapser bestäms sedan baserat på amplituderna av auditiva hjärnstammen svar (ABR) Wave I. Den nuvarande rapporten visar att detta tillvägagångssätt kan användas för att fördjupa vår förståelse av patogenesen och mekanismerna för synaptisk dysfunktion i cochlea, som kan hjälpa till att utveckla nya terapeutiska interventioner.
Introduction
Frekvenser i intervallet cirka 20 u201220 000 Hz kan uppfattas som auditiva stimuli av människor. Mänsklig hörsel är normalt mest känslig nära 1 000 Hz, där den genomsnittliga ljudtrycksnivån är 20 μPa hos unga vuxna (dvs 0 decibel av ljudtrycksnivå [dB SPL]). Vid vissa sjukdomstillstånd är hörselnedsättning begränsad till specifika frekvenser. Till exempel, i de tidiga stadierna av Bullerorsakad hörselnedsättning (NIHL), kan ett “snäpp” (dvs. hörsel tröskel höjning) observeras i audiogrammet vid 4 kHz1. Längs med Cochlears däggdjurs-partition, ger dess graderingar av styvhet och massa en exponentiell frekvens karta, med högfrekvent ljuddetektering vid basen av snäckan och lågfrekventa detektering vid Apex2. Det finns faktiskt en Cochlear plats-frekvenskarta längs basilaris membran, vilket leder till vad som kallas tonotopic organisation2,3. Varje given förlägger på det basilaris membranen har den högsta känsligheten till endast en bestämd solid frekvens, som kallas vanligt den karakteristiska frekvensen3,4, även om svar till andra frekvenser kan också observeras.
Hittills har olika musmodeller använts för att undersöka normal funktion, patologiska processer och terapeutisk effekt i hörselsystemet. Exakt kunskap om fysiologiska parametrar i musen snäckan är en förutsättning för sådana studier av hörselnedsättning. Musen snäckan är anatomiskt uppdelad i apikala, mellersta, och basal varv, som motsvarar olika frekvensområden. Genom att märka hörselnerven afferenter vid Cochlear Nucleus för att analysera deras motsvarande perifera innervation platser i cochlea, Müller et al. lyckades etablera Cochlear plats-frekvenskarta i den normala musen in vivo5. I intervallet 7.2 – 61.8 kHz, vilket motsvarar positionerna mellan 90% och 10% av den fulla längden av basilaris membran, kan mus Cochlear plats-frekvenskarta beskrivas med en enkel linjär Regressions funktion, vilket tyder på en relation mellan normaliserat avstånd från cochleaimbasen och logaritmen av den karakteristiska frekvensen5. I laboratoriemöss kan plats-frekvenskartan användas för att undersöka sambandet mellan hörsel trösklar inom specifika frekvensområden och cochleogram som visar antalet saknade hårceller i relativa regioner längs basilaris membran6. Viktigt, plats-frekvenskartan ger ett positioneringssystem för utredning av minimal strukturell skada, såsom skador på bandet synapser av hårceller vid specifika Cochlear frekvens platser i möss med perifera hörseltrauma7 ,8.
I däggdjur cochlea, band synapser består av ett presynaptiskt band, en elektron-tät projektion som tjusar en Gloria av release-Ready synaptiska blåsor som innehåller glutamat inom IHC, och en postsynaptisk densitet på nerven terminalen i SGN med glutamatreceptorer9. Under Cochlears ljudtransduktion leder avböjning av hår cells paketet till IHC depolarisering, vilket leder till att glutamat frigörs från IHCs till postsynaptiska afferenta terminaler, vilket aktiverar hörselgången. Aktiveringen av denna väg leder till omvandlingen av ljudinducerade mekaniska signaler till en tariff kod i SGN10. Faktum är att IHC Ribbon synaps är mycket specialiserade för Indefatigable ljudöverföring till priser av hundratals Hertz med hög temporal precision, och är av avgörande betydelse för presynaptiska mekanismer för ljudkodning. Tidigare studier har visat att band synapser varierar kraftigt i storlek och antal i olika frekvensområden i den vuxna musen snäckan11,12, sannolikt återspeglar strukturell anpassning till särskilda ljudkodning för överlevnadsbehov. Nyligen har experimentella djurstudier visat att cochleaimsynaptopati bidrar till flera former av hörselskador, inklusive Bullerorsakad hörselnedsättning, åldersrelaterade hörselnedsättning, och ärftlig hörselnedsättning13, 14. metoder för att identifiera korrelerade förändringar i synaptiska tal, struktur och funktion vid specifika frekvensområden har därför blivit alltmer sysselsatta i studier av hörsel utveckling och inre öronsjukdomar, med hjälp av modeller som genererats via experimentell manipulation av genetiska eller miljövariabler15,16,17.
I den aktuella rapporten presenterar vi ett protokoll för analys av synaptiska tal, struktur och funktion vid en specifik frekvens region i basilaris membran hos vuxna möss. Cochlears frekvens lokalisering utförs med en given plats-frekvenskarta i kombination med ett cochleogram. De normala morfologiska egenskaperna hos Cochlear Ribbon synapser utvärderas via presynaptiska och postsynaptiska immunofärgning. Den funktionella statusen för Cochlear Ribbon synapser bestäms baserat på suprathreshold amplituder av ABR Wave I. Med smärre förändringar, detta protokoll kan användas för att undersöka fysiologiska eller patologiska tillstånd i andra djurmodeller, inklusive råttor, marsvin, och gerbils.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom Cochlear synaptopati först karakteriserades hos vuxna möss med en tillfällig tröskel förskjutning (TTS) inducerad av 8 \ u201216 kHz oktavband brus vid 100 dB SPL för 2 h31, forskare har alltmer undersökt effekterna av synaptopati i olika däggdjur, inklusive apor och människor32,33. Förutom bullerexponering, flera andra villkor har förknippats med Cochlear synaptopati (t. ex., åldrande, användning av Ototoxiska läkem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81770997, 81771016, 81830030); det gemensamma finansierings projektet för Beijing Natural Science Foundation och Pekings utbildningskommitté (KZ201810025040); Naturvetenskaps stiftelsen i Peking (7174291); och China postdoc Science Foundation (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
References
- Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
- Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
- Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in “recovered” ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
- Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
- Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
- Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy–neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
- Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
- Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
- Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
- Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
- Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
- Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
- Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
- Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
- Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).
