Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Summary

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan > 1000 TFs in een enkele experiment.

Abstract

Het identificeren van de sets van transcriptiefactoren (TFs) die regelen van elk menselijk gen is een enorme taak die vereist integratie van talrijke experimentele en computationele benaderingen. Een dergelijke methode is de gist één-hybride (Y1H) assay, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met behulp van verslaggever genen. Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (b.v.., initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering. Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H schermen zijn gebaseerd op het omzetten van TF-prooi bibliotheken of arrays in DNA-aas giststammen. Hier beschrijven we een pijpleiding, verbeterde Y1H genoemd (eY1H) testen, waar TF-DNA interacties zijn ondervraagd door de paring van de DNA-aas stammen met een gekleed verzameling TF-prooi stammen met behulp van een array met hoge dichtheid (HDA) robotic platform waarmee screening in een 1,536 de indeling van de kolonie. Dit zorgt voor een dramatische toename van de doorvoer (60 opeenvolgingen van DNA-aas tegen > 1.000 TFs duurt twee weken per onderzoeker) en reproduceerbaarheid. We illustreren de verschillende soorten van de verwachte resultaten door het testen van sequenties van menselijke promotor tegen een array van 1,086 menselijke TFs, evenals voorbeelden van problemen die zich kunnen voordoen tijdens de schermen en het oplossen van hen.

Introduction

Een centraal probleem op het gebied van biomedische is het bepalen van de mechanismen waarmee elk menselijk gen wordt geregeld. Transcriptie is de eerste stap bij het beheersen van gen expressie niveaus, en het is geregeld door sets van transcriptiefactoren (TFs) die uniek voor elk gen zijn. Gezien het feit dat mensen coderen voor > 1500 TFs^1,2, identificatie van de complete set van TFs waarmee de expressie van elk gen blijft een open uitdaging.

Twee soorten methoden kunnen worden gebruikt voor het toewijzen van TF-DNA interacties: TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methode

Protocol

1. voorbereiding

1. SC −U −H platen (petrischalen 150 mm)
   Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van de DNA-aas giststammen.
   1. Los van de drop-out mix, gist stikstof base (YNB), adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met 5 M NaOH (ongeveer 1 mL per liter media; Zie tabel 2 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.
   2. In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).
   3. Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 ....

Results

Drie belangrijke factoren moeten worden beschouwd wanneer analyseren van resultaten van eY1H assays: de achtergrond verslaggever activiteit van de DNA-aas-stam, de sterkte van de activiteit van de verslaggever overeenkomt met TF-DNA interacties, en het aantal positieve kolonies. De achtergrond verslaggever activiteit (bijvoorbeeld autoactivity) van de DNA-aas stam verwijst naar de algemene groei en kleur van de kolonies van de gist in de uitlezing plaat, zelfs in de afwezigheid van een TF-prooi. Ideaal, niet-autoactive s.......

Discussion

De robotic eY1H paring screening beschreven aanpak hier sterk verhoogt de doorvoer ter identificatie van de set van TFs die zich aan een DNA-regio van belang binden, in vergelijking met vorige bibliotheek screening of gekleed screening benaderingen gebaseerd op transformatie. Verder, de TF-DNA-interacties die zijn gedetecteerd door eY1H testen zeer reproduceerbaar, zijn 90% van interacties genotypes zijn positief voor alle vier kolonies per TF getest, en 90% van interacties opnieuw testen in een onafhankelijke scherm van.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC	Sigma	A8056-100G	Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate	US Biologicals	A0865	Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade	American International Chemical	AGHGUP	Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate	US Biologicals	A1450	Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous	US Biologicals	G3050	Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base	US Biologicals	D9540-02	Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter	Hanna Instruments	HI2020-01	To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct	Diamond		To streak yeasts on petridishes
Glass Beads	Walter Stern	100C	To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99%	Millipore Sigma	G9012-1L	Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine	US Biologicals	H5100	For yeast growth selection in selective media
L-Leucine	US Biologicals	L2020-05	For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan	Sigma	T-0254	For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide	Sigma	319937-1L	To make X-gal solution
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological	American International Chemical	PEBAUP	Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm	VWR	10753-950	For growing yeast baits for screening
PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator	ThermoFisher Scientific	PR205745R	To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short	Singer Instruments	REP-005	To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short	Singer Instruments	REP-004	To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long	Singer Instruments	REP-001	To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short	Singer Instruments	REP-002	To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot	Singer Instruments		For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)	Fisher	S318-1	For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Santa Cruz Biotechnology	sc-203402C	Required for LacZ reporter activity on X-gal
Sodium Phosphate monobasic monohydrate	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	Required for LacZ reporter activity on X-gal
Uracil	Sigma	U0750-100G	For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)	Gold Biotechnology	X4281C100	β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract	US Biologicals	Y2010	Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS	US Biologicals	Y2030	Required for vigorous yeast growth