Intramucosal vaksinasjon av Squamous celle Carcinoma celler i mus for svulst immun profilering og behandling respons vurdering

Summary

Her presenterer vi en reproduserbar metode for å utvikle en orthotopic murint modell av hodet og nakken squamous celle carcinoma. Svulster viser klinisk relevante histopathological funksjoner av sykdommen, inkludert nekrose, dårlig differensiering, knutepunktet metastaser og immun infiltrasjon. Svulst-bærende mus utvikle klinisk relevante symptomer inkludert dysfagi, kjeven forskyvning og vekttap.

Abstract

Hodet og nakken squamous celle carcinoma (HNSCC) er en ødeleggende og dødelig sykdom med høy prevalens regelmessighet og behandling feil. For å utvikle bedre strategier, forståelse svulst microenvironmental faktorer som bidrar til behandling motstanden er viktig. Et stort hinder å forstå sykdom mekanismer og forbedre terapi har vært en mangel på murine linjer som ligner den aggressive og metastatisk naturen menneskelige HNSCCs. Videre fleste murine modeller ansette subkutan implantations av svulster som mangler viktige fysiologiske funksjoner i hodet og nakken regionen, inkludert vaskulær kompakt, omfattende lymfatisk blodkar og bosatt mucosal flora. Formålet med denne studien er å utvikle og karakterisere en orthotopic modell av HNSCC. Vi bruker to genetisk distinkte murine cellelinjer og etablerte svulster i bukkal mucosa mus. Vi optimaliserer collagenase-baserte svulst fordøyelsen metoder for optimal utvinning av enkeltceller fra etablerte svulster. Dataene som presenteres her viser at mus utvikle svært Stangeriaceae svulster som metastase til regionale lymfeknuter. Encellede multiparametric masse cytometri analyse viser tilstedeværelse av forskjellige immun befolkningsgrupper med myeloide celler som representerer fleste av alle immunceller. Modellen foreslått i denne studien har programmer i kreft biologi, svulst immunologi og prekliniske utvikling av romanen therapeutics. Likheten med orthotopic modellen til kliniske funksjoner for menneskelig sykdom vil gi et verktøy for forbedret oversettelse og bedre pasientens utfall.

Introduction

HNSCC er den femte vanligste malignancy globalt, med over 600 000 pasienter diagnostisert årlig¹. Til tross for aggressiv behandling med kjemoterapi og strålebehandling (RT), total (OS) overlevelse for HNSCC pasienter uten humant papillomavirus (HPV)-infeksjon fortsatt under 50% etter 5 år². Dette skyldes i stor grad til en svært komplekse svulst microenvironment som svulster kan stamme fra flere forskjellige anatomiske steder i hodet og nakken regionen, inkludert bukkal mucosa, tunge, gulv av munnen, nasal hulheten, munnhulen, svelg, oropharynx og hypopharynx. I tillegg hodet og nakken regionen er svært Stangeriaceae og inneholder nesten halvparten av alle lymfeknuter i kroppen³. Et flertall av studier undersøker hodet og nakken svulst biologi bruker svulst modeller i regionen flanke. Slike modeller kan gi innsikt i svulst-innebygde mekanismer, men mangel på det opprinnelige hodet og nakken microenvironment kan betydelig påvirke translasjonsforskning potensialet i slike funn. En metode som er brukt til å indusere muntlig svulster er gjennom eksponering til kreftfremkallende 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA)⁴. Men denne metoden er forbundet med en lang prosess, forårsaker svulster i rotter og hamstere, men ikke i mus, og den resulterende svulst ikke har mange av de histologiske differensiert SCCs^5,6. Introduksjonen av carcinogen4-nitroquinoline 1-oksid (4-NQO), en vannløselig kinolin derivat, resulterte i musen muntlig svulster når brukt muntlig, men også led av lange eksponeringstider (16 uker) og en begrenset ta innenfor og mellom grupper mus^7,8,9. For å utvikle klinisk relevante modeller, benyttet flere grupper genmodifiserte modeller som involverer manipulering av driveren oncogenes eller tumor suppressor gener, inkludert TP53, TGFB, KRAS, HRAS og SMAD4¹⁰. Disse modellene kan tilby innsikt svulster med kjente driveren gener, men er recapitulate ikke den komplekse heterogeniteten av menneskelig HNSCCs.

I dette arbeidet viser vi muligheten til å utføre en intramucosal vaksinering squamous celle carcinoma celler i mus. Inokulerte cellene utvikle i aggressiv svulst innen 1 uke etter injeksjon. Ligner menneskelige HNSCCs, svulstene metastase til regionale lymfeknuter. Vi karakteriserer histologiske og kliniske funksjoner av sykdommen og gi innsikt i svulst immun microenvironment. Vi foreslår at denne orthotopic modell av HNSCC har programmer i kreft biologi, svulst immunologi og prekliniske studier. Mekanismer for immun evasion, svulst progresjon, behandling motstand og metastaser representerer områder av klinisk betydning som kan løses ved hjelp av foreslåtte modellen.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med en godkjent institusjonelle dyr omsorg og bruk committee (IACUC) protokoll fra University of Colorado Denver (protocol # 00250). 1. svulst cellekultur Merk: B4B8 og LY2 linjer ble brukt til å generere orthotopic HNSCC svulster: B4B8 tumorceller var avledet fra karsinogen-forvandlet mucosal keratinocytter (fra BALB/C mus)11. LY2 tumorceller var avledet fra lymfeknute metastaser et s…

Representative Results

I vitro vurdering av LY2 og B4B8 celle spredning viste at begge linjer har samme dobling tid (21 h og 23 h, henholdsvis). In vivo, begge cellelinjer dannet en enkelt, synlig og håndgripelig masse 1 uke etter vaksinering (figur 1A). I mus med LY2 svulster, var kjeven fortrengt av 3 uker på grunn av svulst byrden (figur 1A). Kontroll mus som ikke fikk kreftceller utvikle ikke svulster som forventet. LY2 svulster vokste på en hø…

Discussion

Grundige analyser og karakterisering av svulst microenvironment representerer en viktig strategi for forståelse mekanismer av tumor utvikling, progresjon og metastaser og utviklingen av effektive behandlingsformer. Hode og nakke kreft er en komplisert sykdom som kan stamme fra flere anatomiske områder i hodet og nakken regionen. Et stort hinder å forstå sykdom mekanismer og forbedre terapi har vært en mangel på murine musen linjer som ligner den aggressive og metastatisk naturen menneskelige HNSCCs. Videre ansette …

Materials

Collagenase III	Worthington Biochemical Corp.	LS004183
DNase I	Worthington Biochemical Corp.	LS006328
Fc Block (CD16/32)	BD Biosciences	553141	Clone 2.4G2
Flow Cytometry Staining Buffer	eBioscience	00-4222-26
HBSS	ThermoFisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no pheno red
Helois mass cytometer	Fluidigm	NA
Matrigel membrane matrix	Corning	CB-40234B
MRI Scanner	Bruker	NA	7.4 Tesla
RBC lysis buffer	BioLegend	420301
Trypsin inhibitor	Worthington Biochemical Corp.	LS002830