Intramucosal inokulering av skivepitelcancer celler i möss för tumör immun profilering och svar bedömning

Summary

Här presenterar vi en reproducerbar metod för att utveckla en ortotop murina modell av huvud och hals skivepitelcancer. Tumörer visar kliniskt relevanta histopatologiska funktioner av sjukdomen, inklusive nekros, dålig differentiering, nodal metastaser och immun infiltration. Tumör-bärande möss utvecklar kliniskt relevanta symtom inklusive dysfagi, käken förskjutning och viktminskning.

Abstract

Huvud och hals skivepitelcancer (SchH) är en försvagande och dödliga sjukdom med hög prevalens av upprepning och behandlingssvikt. För att utveckla bättre terapeutiska strategier, förståelse tumör microenvironmental faktorer som bidrar till behandling motståndet är viktigt. Ett stort hinder för att förstå sjukdomsmekanismer och förbättra terapi har varit en brist murina cellinjer som liknar den aggressiva och metastaserande karaktären av mänskliga HNSCCs. Dessutom sysselsätter en majoritet av murina modeller subkutan implantationer av tumörer som saknar viktiga fysiologiska funktioner i regionen huvud och hals, inklusive hög vaskulär densitet, omfattande lymfatiska kärl och bosatt slemhinnor flora. Syftet med denna studie är att utveckla och karakterisera en ortotop modell av SchH. Vi använder två genetiskt distinkta murina cellinjer och etablerade tumörer hos möss buckala slemhinna. Vi optimerar kollagenas-baserade tumör matsmältningen metoder för optimal återhämtning av enstaka celler från etablerade tumörer. De data som presenteras här visar att möss utvecklar högt vaskulariserad tumörer som metastaser till regionala lymfkörtlar. Encelliga multiparametric massa flödescytometri analys visar förekomsten av olika immun befolkningsgrupper med myeloida celler som representerar majoriteten av alla immunceller. Den modell som föreslås i denna studie har tillämpningar inom Cancerbiologi, tumör immunologi och preklinisk utveckling av nya behandlingar. Likheten av ortotop modellen till kliniska drag av mänskliga sjukdomar ger ett verktyg för förbättrad översättning och förbättrade behandlingsresultat.

Introduction

SchH är den femte vanligaste malignitet globalt, med över 600 000 patienter diagnostiseras årligen¹. Trots aggressiv behandling med kemoterapi och strålbehandling (RT), förblir den totala överlevnaden (OS) för SchH patienter utan humant papillomvirus (HPV) infektion under 50% efter 5 år². Detta tillskrivs i hög grad en mycket komplex tumör närmiljön som tumörer kan komma från flera olika anatomiska platser inom regionen huvud och hals, inklusive buckala slemhinna, tunga, golvet i munnen, näshålan, munhålan, svalget, orofarynx och hypofarynx. Dessutom regionen huvud och hals är högt vaskulariserad och innehåller nästan hälften av alla lymfkörtlar i kroppen³. En majoritet av studier som undersöker huvud och hals tumörbiologi lita på tumör modeller i regionen flanken. Sådana modeller kan erbjuda inblick i tumör-inneboende mekanismer, men avsaknaden av den infödda huvud och hals närmiljön kan avsevärt påverka translationell potentialen för sådana slutsatser. En metod som har använts för att framkalla muntliga tumörer är genom exponering för cancerframkallande 9,10-dimetyl-1,2-benzanthracene (DMBA)⁴. Denna metod är dock associerade med en utdragen process, inducerar tumörer hos råttor och hamstrar men inte i möss, och de resulterande tumörerna inte besitter många av de histologiska funktionerna av differentierade SCCs^5,6. Införandet av den carcinogen4-nitroquinoline 1-oxiden (4-NQO), ett vattenlösligt kinolon derivat, resulterade i mus muntliga tumörer när tillämpas muntligen men också lidit av långa exponeringstider (16 veckor) och en begränsad ta kurs inom och mellan serier möss^7,8,9. För att utveckla kliniskt relevanta modeller, utnyttjade flera grupper genetiskt modifierade modeller som inbegriper manipulation av drivrutinen onkgener eller tumörsuppressorgener, inklusive TP53, TGFB, KRAS, HRAS och SMAD4¹⁰. Dessa modeller kan erbjuda inblick i tumörer med kända förare gener men sammanfatta inte de komplexa heterogena mänskliga HNSCCs.

I detta arbete demonstrera vi genomförbarheten av utför en intramucosal inympning av skivepitelcancer celler i möss. Inokulerade celler utvecklas till aggressiva tumörer inom 1 vecka efter injektionen. Liknar mänskliga HNSCCs, tumörer metastasera till regionala lymfkörtlar. Vi karakterisera histologiska och kliniska funktioner av sjukdomen och ge insikt i den tumör immun mikromiljö. Vi föreslår att denna ortotop modell av SchH har tillämpningar inom Cancerbiologi, tumör immunologi och prekliniska studier. Mekanismer för immun skatteflykt, tumör progression, behandlingsresistens och metastaser representerar områden av klinisk betydelse som kan lösas med den föreslagna modellen.

Protocol

Alla djur förfaranden utfördes i enlighet med en godkänd institutionella djurens skötsel och användning kommittén (IACUC) protokoll vid University of Colorado Denver (protokoll nr 00250). 1. tumör cellkultur Obs: B4B8 och LY2 cellinjer användes för att generera ortotop SchH tumörer: B4B8 tumörceller härleddes från cancerframkallande-omvandlad slemhinnor keratinocyter (från BALB/C-möss)11. LY2 tumörceller härled…

Representative Results

In vitro-bedömningen av proliferation av LY2 och B4B8 visade att både cellinjer har liknande fördubbling gånger (21 och 23 h, respektive). In vivo, både cellinjer bildade en enda, synlig och påtaglig massa inom 1 vecka efter inympningen (figur 1A). I möss med LY2 tumörer, förflyttades käken av 3 veckor på grund av tumör börda (figur 1A). Kontroll möss som inte fått tumörceller utvecklade inte tumörer som förvän…

Discussion

Noggrann analys och karakterisering av de tumör närmiljön utgör en viktig strategi för förståelse mekanismer för tumörutveckling, progression och metastaser och för utvecklingen av effektiva behandlingar. Huvud och hals cancer är en komplex sjukdom som kan härröra från flera anatomiska platser inom regionen huvud och hals. Ett stort hinder för att förstå sjukdomsmekanismer och förbättra terapi har varit en brist murina mus cellinjer som liknar den aggressiva och metastaserande karaktären av mänskliga…

Materials

Collagenase III	Worthington Biochemical Corp.	LS004183
DNase I	Worthington Biochemical Corp.	LS006328
Fc Block (CD16/32)	BD Biosciences	553141	Clone 2.4G2
Flow Cytometry Staining Buffer	eBioscience	00-4222-26
HBSS	ThermoFisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no pheno red
Helois mass cytometer	Fluidigm	NA
Matrigel membrane matrix	Corning	CB-40234B
MRI Scanner	Bruker	NA	7.4 Tesla
RBC lysis buffer	BioLegend	420301
Trypsin inhibitor	Worthington Biochemical Corp.	LS002830