نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين كريسبر-Cas9 لتحقيق خصوصية أعلى دون فقدان النشاط على الهدف. نحن استخدام نهج تطور موجه تسمى قناص-الشاشة لتجد متحولة Cas9 مع الخصائص المرغوبة. قناص–Cas9 متوافق مع مبتوراً واحد-دليل الكشف والتسليم في شكل ريبونوكليوبروتين، الاستراتيجيات المعروفة لتحقيق خصائص أعلى.
تطوير مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)-البروتينات المرتبطة بها 9 (Cas9) إلى الطرائق العلاجية يتطلب تجنب إثارة خارج الهدف يحتمل أن تكون ضارة. وتم استحداث عدة طرق للحد من هذه الآثار. نقدم هنا، الإشريكيّة القولونية-التطور الموجه استناداً إلى أسلوب يسمى قناص-الشاشة للحصول على متغير Cas9 مع خصوصية الأمثل والاحتفاظ بالنشاط على الهدف، دعا قناص-Cas9. استخدام شاشة قناص، التحديد الإيجابية والسلبية يمكن أن يؤديها في وقت واحد. كما يمكن أن يتكرر الشاشة مع غيرها تسلسل الحمض النووي الريبي (سجرنا) واحد-دليل لإثراء ليضرب إيجابية حقيقية. باستخدام المروج المزدوج CMV-PltetO1 للتعبير عن المتغيرات Cas9، يمكن التحقق أداء المكتبة مجمعة بسرعة في خلايا الثدييات. ويرد أيضا أساليب لزيادة خصوصية قناص-Cas9. أولاً، استخدام سجرناس مبتوراً سابقا قد ثبت لزيادة خصوصية Cas9. خلافا لغيرها Cas9s هندسيا، يحتفظ Cas9 قناص البرية من نوع (WT) مستوى النشاط على الهدف عندما جنبا إلى جنب مع سجرناس مبتورة. ثانيا، إيصال قناص Cas9 في شكل ريبونوكليوبروتين (رنب) بدلاً من تنسيق بلازميد ممكن دون التأثير على نشاطها على الهدف.
في هذه الورقة، ونحن نهدف إلى تحسين خصوصية Cas9 عن طريق الجمع بين استراتيجيات مختلفة. وقد وضعت أساليب مختلفة لتجنب آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9. على سبيل المثال، يمكن استخدام سجرناس مبتوراً لتحقيق أعلى خصوصية1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تغيير طريقة تسليم Cas9 من شكل بلازميد إلى تنسيق رنب للحصول على أعلى خصوصية2. بقايا محددة من الأحماض الأمينية Cas9 العقدية المقيّحة البروتين (SpCas9) قد تم تعديلها وفقا للرشيد تصميم الموصوفة سابقا3،،من45. بدلاً من ذلك، مخلفات الأحماض الأمينية قد تم تعديلها بطريقة عشوائية، وتم تحديد المتغيرات Cas9 مع خصوصية أعلى باستخدام خميرة6 أو7، كولاي8 فحص النظام.
ومع ذلك، أفادت العديد من المجموعات أن المتغيرات Cas9 هندسيا باستخدام التصميم لإضعاف التفاعل غير محدد بين Cas9 والركيزة معرض منخفضة في توجيه الأنشطة7،،من89، 10 , 11 , 12-قمنا بتطوير كولاي-استناداً إلى نظام التطور الموجه، قناص-الشاشة الشاشة عشوائياً موتاجينيزيد Cas9 المتغيرات. كولاي فحص النظام مزايا أكثر من نظام خميرة بسبب كفاءات التحول وقتاً وأعلى سرعة مضاعفة كولاي.
التحديد السلبية والإيجابية على حد سواء، استناداً إلى ثلاثة والبلازميدات مختلفة وجينات للفائدة (غوي) دمج الجينوم كولاي ، تستخدم في شاشة قناص. يتم التعبير عن المتغيرات Cas9 تحت النظام المزدوج-مروج CMV-PltetO1 بلازميد رقم نسخة منخفضة حيث أنه يمكن أن يكون اختبار المرشحين التي تم تحديدها في كولاي في خلايا الثدييات دون الحاجة إلى سوبكلونينغ. هو عرض حكومة الهند في مجال المجين كولاي باستخدام نظام ينقول Tn7. بلازميد سجرنا، الذي يحتوي على مصدر حساسة للحرارة للنسخ المتماثل، وتعرب عن سجرنا الاستهداف غوي؛ ومع ذلك، سجرنا وتسلسل غوي عدم مطابقة تماما. يوجد موقع هدف سجرنا مطابقة تماما في بلازميد ثالثة التي تحتوي على الجين ككدب ، الذي يقوم بترميز منتجات مميتة التي السموم جيرسي. في هذا النظام، تتم إزالة الخلايا معربا عن المتغيرات Cas9 مع أنشطة خارج الهدف السامي لفواصل مزدوجة-ستراند (دسبس) تدخل في الموقع غير مطابقة الموجود في الحمض النووي الجينوم. من ناحية أخرى، يتم أيضا إزالة الخلايا معربا عن المتغيرات Cas9 مع انخفاض في توجيه الأنشطة بسبب الجينات القاتلة ككدب . يمكن تغيير مستوى التعبير من المتغيرات Cas9 بتغيير تركيز أنهيدروتيتراسيكليني (ATC)، الذي يضبط قوة الاختيار.
نحن مسبب أن تحديد موقع الهدف سجرنا غير متطابقة في الحمض النووي الجينومي بدلاً من بلازميد سيزيد من حساسية النظام. وميزة هذا النهج أن هناك موقع جينومي واحد فقط، في حين سيكون هناك العديد من البلازميدات، كل منها يحتوي على موقع هدف، ضمن واحدة خلية كولاي .
باستخدام هذا النظام، وقد حددنا متغير Cas9، قناص-Cas9، الذي يبين مستوى وزن في توجيه الأنشطة وتخفيض الأنشطة خارج الهدف مقارنة بوزن Cas9. قناص–Cas9 تحقيق أعلى نسب خصوصية باستخدام سجرناس مبتوراً أو التسليم على أساس رنب بدلاً من التسليم على أساس بلازميد.
تتوفر لأولئك الذين يرغبون في تجنب إجراءات الفرز مرهقة للحصول على Cas9 قناص، البروتين Cas9 قناص وبلازميد الترميز. باستخدام هذه المواد، وطول سجرنا، التي توفر أعلى نسبة خصوصية، ينبغي تحديد أمثل. وباﻹضافة إلى ذلك، يوصي بتسليم القناص-Cas9 وسجرنا في شكل رنب نظراً لأنه عادة ما يؤدي إلى خصوصية أعلى نسبة من التسليم في شكل بلازميد. خلافا للقناص-Cas9، متغيرات Cas9 هندسية أخرى غير متوافقة مع6،سجرناس مبتوراً7 أو التسليم في رنب الاستمارة رقم8 (باستثناء هيفي-Cas9).
لقناص-الشاشة، يتم اختيار التسلسل غير متطابقة أهم خطوة. وينبغي تجنب اختيار سجرنا غير متطابق الذي يقترن بالانقسام وانخفاض النشاط نحو تسلسل غوي . إذا لم يكن الأمر كذلك، سوف لا تنشق المتغيرات Cas9 بمستوى WT خصوصية كولاي المجينية الحمض النووي مع الموقع الهدف غير متطابقة. هذا التأثير سيؤدي إلى عدد كبير من المستعمرات الخلفية، تعرض للخطر كل الفحص الداخلي.
سبب كولاي بسرعة مضاعفة الوقت وكفاءة تحويل عالية مقارنة بالخميرة، قناص-الشاشة هو فائدة مقارنة بأساليب الفرز على أساس الخميرة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون القناص-الشاشة أكثر حساسية من غيرها كولاي-استناداً إلى النظم التي تتم في الموقع غير متطابقة بلازميد: هناك نسخة واحدة من الحمض النووي الجينومي وواحد فقط وبالتالي نسخة من الموقع غير متطابقة في نظامنا، ولكن عددا كبيرا من والبلازميدات داخل وحيدة الخلية كولاي .
ويمكن أيضا تحسين خصائص أخرى اندونوكليسيس الحمض النووي التي تحفز دسبس، مثل SaCas9 أو Cpf1s، أو باستخدام شاشة قناص. ولسوء الحظ، لا يمكن استخدام شاشة قناص زيادة خصوصية المحررين قاعدة مباشرة، نظراً لعدم حمل المحررين قاعدة دسبس في الحمض النووي الجينومي كولاي. كما استخدم المحررين قاعدة نيكس أو إصدار الميت من Cas9 في جوهر النظام الخاص بهم، يمكن زيادة الخصائص المميزة للمحررين قاعدة باستخدام عدد الزيارات التي تم الحصول عليها من قناص-الشاشة.
The authors have nothing to disclose.
كان يؤيد هذا البحث من المنح المقدمة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات من كوريا (2017M3A9B4061406) والوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) التي تمولها الحكومة الكورية (مست) (منحة الأرقام 2017M3A9B4061404 و 2018M3A9H3020844) إلى جونججون ك. لي. بلازميد ترميز pGRG36 كان هدية من نانسي كريغ (بلازميد أدجيني #16666) وكان p11-أسي wtx1 هدية من تشاو هويمين.
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | NEB | M0290L | |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher Chemical | BP1760-25 | |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma Aldrich | 37919 or 94664 | |
Antibiotic Antimycotic solution | Welgene | LS203-01 | Media component |
BamHI | Enzynomics | R003L | |
Chloramphenicol | Sigma Aldrich | R4408 | |
Diversify PCR Random Mutagenesis | Clontech | 630703 | Error-prone PCR kit |
DNA-Shuffling Kit | Jena Bioscience | PP-103 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM001-17 | Culture media |
Endura Electrocompetent Cells (DUO) | Lucigen | 60242-2 | E. coli electrocompetent cells for library preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Welgene | S101-01 | Media component |
Gene Pulser II | Bio-Rad | E. coli electroporation equipment | |
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit | Agilent | 200550 | Error-prone PCR kit |
genomic DNA prep kit | GenAll | 106-152 | gDNA-prep kit |
Glycerol | BioShop | GLY001.1 | |
GP/MP Cuvette, 0.1cm | Bio-Rad | BR165-2089 | E. coli electroporation equipment |
HEK293T cell | ATCC | CRL-11268 | Human cell line |
Kanamycin sulfate | Acros Organics | 450810500 | |
L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A3256-25G | |
LaboPass PCR Purification Kit | Cosmogenetech | CMR0112 | |
LaboPass Plasmid Mini | Cosmogenetech | CMP0112 | Mini-prep kit |
LB Agar Miller | Formedium | LMM0202 | |
LB Broth Miller | Formedium | LMM0102 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture |
Neon Transfection System | Thermo | MPK5000 | RNP Electroporation equipment |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo | MPK1096 | RNP Electroporation equipment |
NucleoBond Xtra Midi EF | Macherey-Nagel | 740420.50 | Midi-prep kit |
Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | DNA purification kit that enables low-volume elution |
Opti-MEM | Gibco | LS31985070 | Transfection media |
p11-lacY-wtx1 | Addgene | #123945 | |
pgrg36 | Addgene | #16666 | E. coli mutator strain |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
Pyrophophatase | NEB | M2403L | |
Ribonucleotide Solution Set | NEB | N0450L | |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | |
T7 RNA polymerase | NEB | M0251L | |
Turbo Dnase | Ambion | AM2238 | |
XbaI | Enzynomics | R013L | |
XL1-Red Competent Cells | Agilent | 200129 |