여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품
이 논문에서
요약
초록
비 인간 영장류 (NHP) 광유전학에서, 바이러스 성 벡터로 큰 피질 영역을 감염하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 여기에서, 우리는 1 차적인 체감각 (S1) 및 모터 (M1) 원숭이의 피질 피질 로 광유전학 적 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도 대류 강화 전달 (CED)의 사용을 입증하여 효율적이고 광범위한 피질 발현을 얻습니다. 빛에 민감한 이온 채널. 황색 형광 단백질(EYFP)에 융합된 적색 이동 opsin C1V1을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 MR-유도 CED 하에서 코막강 마카크의 피질내로 주입되었다. 3개월 후 주입 후, 에피인광 이미징은 2개의 원숭이에서 M1 및S1에서 광유전학적 발현(>130 mm2)의 큰 영역을 확인하였다. 또한, 마이크로 전기 코르티코그래피 어레이를 사용하여 표현 영역에서 신뢰할 수 있는 빛을 불러일으킨 전기 생리학적 반응을 기록할 수 있었습니다. 나중에 리포터에 대한 조직학적 분석 및 면역 염색은 후피광성 이미징에 의해 지시된 분포에 대응하는 M1 및 S1에서 광범위하고 조밀한 광유전학적 발현을 밝혀냈다. 이 기술은 우리가 전통적인 기술에 비해 최소한의 손상으로 시간의 짧은 기간 내에 피질의 넓은 영역에 걸쳐 발현을 얻을 수 있게 하고 NHPs와 같은 큰 동물에 있는 광유전학 바이러스성 납품을 위한 최적 접근일 수 있습니다. 이 접근법은 인간과 진화적으로 가까운 동물 모델에서 세포 유형 특이성을 가진 신경 회로의 네트워크 수준 조작에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.
서론
광유전학은 신경 활동의 조작과 뇌의 네트워크 연결 연구를 허용하는 강력한 도구입니다. 비 인간 영장류에서이 기술을 구현 (NHPs) 대규모 신경 계산의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다, 인식, 그리고 영장류 두뇌에 행동. 광유전학이 최근 몇 년 동안 NHP에서성공적으로 구현되었지만 1, 2,3,4,5,6,7, 연구원 얼굴은 이 동물에 있는 큰 두뇌 지역에 걸쳐 표현의 상부를 달성하고 있습니다. 여기에서, 우리는 원숭이에 있는 피질의 넓은 지역에 걸쳐 광유전학 표현의 상부를 달성하기 위하여 능률적이고 간단한 접근을 제공하고 있습니다. 이 기술은 최첨단 기록8,9 및 광학 자극10 기술과 함께 이러한 동물의 현재 광유전학 연구를 향....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 절차는 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다. 다음 의 절차는 각각 17.5 kg 및 16.5 kg (원숭이 G 및 원숭이 J)의 무게, 8 및 7 세의 성인 남성 rhesus 원숭이 2 개를 사용하여 수행되었다.
참고: 모든 수술에 표준 무균 기술을 사용하십시오.
1. 기준선 이미징
- 동물을 진정시키고 삽관하고 이소플루란 하에서 전신 마취를 유지하십시오 (호흡률 및 심박수와 같은 활력 징후에 따라 필요에 따라 농도가 0에서 5 % 사이로 변경됩니다). 절차 전반에 걸쳐 동물의 온도, 심박수, 산소 포화도, 심전도 반응 및 CO2의 말조 부분 압력을 모니터링합니다.
- 동물을 MR 호환 입체 프레임(재료 표참조)에 놓고 이 프레임은 절차 전체에 걸쳐 유지됩니다. 동물을 휴대용 MR 호환 isoflurane 기계에 연결하고 MRI 스캐너 (3 T)로 운반하십시오.
- 표준 T1(플립 각도 = 9°, 반복 시간/에코 시간 = 668.6, 매트릭스 크기 = 192 x 192 x 80, 슬라....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
MRI 지침에 따라 대류 향상된 전달 (CED)
바이러스 벡터의 확산은 온라인 MR 이미지의 지도하에 CED 주입동안 모니터링되었다(도 3A). 본 연구에서는, 두 마리의 원숭이의 S1및 M1을 표적으로 하였다(도 3B). 3차원 분포량은 Yazdan-Shahmorad 등 에서 설명한 바와 같이 MR 이미지(그림3C)의사후 분석에서 추정되었으며, 2016년 9월 9일, 피질의 넓은 영역의 커버리지를 확인하였다. 원숭이 G에 대한 M1 주입은 시간 제약으로 인해 MR 안내없이 수행되었습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에서, 우리는 MR 유도된 CED에 의하여 NHP 1 차 체감각 및 모터 피질에 있는 대규모 광유전학 표현을 달성하기위한 실행 가능하고 능률적인 기술을 개략적으로 설명합니다. MR 유도 CED의 사용은 NHP 두뇌에 있는 바이러스성 주입의 전통적인 방법에 비해 중요한 이점을 제시합니다. 이러한 장점 중 하나는 필요한 주입이 적은 넓은 영역에 대한 발현을 달성할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 종래의 방법으로, 2-3 mm 직경 영역 1,2,5,17에서벡터 항복 발현의 1-2 μL의 다중 주사. 대규모 벡터 확산을 달성하기위한 이전의 시도는 여러 주사18로약 10mm3의 발현 량을 산출했지만, 여기에서우리는 몇 가지 주입만으로 200 m.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
PNS는 뇌 자극을 이용한 임상 치료를 개발하는 회사인 Neuralink Corp.에 재정적 관심을 가지고 있습니다.
감사의 글
이 작품은 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다 (AY), 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) 구조 조정 및 가소성 부상 복구를 가속화하기 위해 (수리; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, UCSF 신경 과학 이미징 센터에 의해. 이 작품은 또한 수상 번호 K12HD073945, 워싱턴 국립 영장류 연구 센터 (WaNPCR, P51 OD010425)에 따라 국립 보건원의 유니스 케네디 시버 국립 연구소및 인간 개발에 의해 지원되었다 신경 기술 센터 (CNT, 그랜트 EEC-1028725에서 국립 과학 재단 공학 연구 센터). 카밀로 디아즈 보티아, 팀 핸슨, 빅토르 카라지아, 다니엘 실버스미스, 카렌 J. 맥클리오드, 줄리아나 밀라니, 블레이클리 앤드류스가 실험과 난 티안, 지웨이 허, 피터 레도쇼이치, 미셸 마하르비즈, 토니 하운의 도움을 받아 준 것에 대해 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL 고압 IV 튜빙 | Smiths Medical Inc., 더블린, 오하이오, 미국 | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD 실리카 튜빙 | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD 실리카 튜빙 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, 펜실베니아 | ||
| ABS 플라스틱 | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| 항균 절개 드레이프 | 3M | 6650EZ | 이오반 드레이프 |
| 치과 아크릴 | Henry Schein, Inc. | 1013117 | 아크릴 결합제 |
| 엘리베이터 | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck 엘리베이터, 와이드 팁 |
| 미세 봉합사 | McKesson Medical-Surgical Inc. | ||
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| 광 자극용 레이저 | Omicron-Laserage, 독일 | PhoxX 488-60 | |
| MR 호환 3cc 주사기 | Harvard 장치, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR 이미징 소프트웨어 | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR 호환 펌프 | 하버드 장치, 홀리스턴, 매사추세츠, 미국 | Harvard PHD 2000 | |
| MR 호환 입위 프레임 | KOPF | 1430M MRI | |
| 페리픽스 클램프 스타일 카테터 커넥터 | B-Braun, 베들레헴, 펜실베니아, 미국 | N/A | |
| 플라스틱 나사 | 플라스틱 1 | 0-80 x 1/8N | 나일론 나사 |
| 티타늄 나사 | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | 셀프 태핑 뼈 나사 |
| Trephine | GerMedUSA Inc,SKU | :GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D 프린터 | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| 습식 멸균 흡수성 젤라틴 | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | 젤폼 |
참고문헌
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-3....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
