Prøve forberedelse metode til scanning og transmission elektron mikroskop til tilhæng af træborebille
Summary
For at observere ultrakonstruktion af insektsensilla blev der i undersøgelsen fremlagt en prøveforberedelsesprotokol (SEM og TEM) for at observere ultrakonstruktion af insektsensilla. Tween 20 blev tilsat i fiksativ at undgå prøvedeformation i SEM. Fluorescensmikroskopi var nyttigt til at forbedre udskæringsnøjagtigheden i TEM.
Abstract
Denne rapport beskrev prøvepræparatmetoder, scanning og transmission elektron mikroskop observationer, demonstreret ved at forberede vedhæng af træborebillen, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), for begge typer elektron mikroskopi. Prøveforberedelsesprotokollen (scanningselektronmikroskopi) var baseret på prøvekemisk fiksering, dehydrering i en række ethanolbade, tørring og sputter-belægning. Ved at tilføje Tween 20 (Polyoxyethylen sorbitan laurat) til fiksativ og vask opløsning, insektkroppen overflade træborebille blev vasket mere rent i SEM. Denne undersøgelse’s transmission elektron mikroskopi (TEM) prøve forberedelse involveret en række trin, herunder fiksering, ethanol dehydrering, indlejring i harpiks, positionering ved hjælp af fluorescens mikroskopi, skæring, og farvning. Fiksativ med Tween 20 aktiveret trænge ind i insektlegemevæggen af træborebille lettere end det ville have været uden Tween 20, og efterfølgende bedre fast væv og organer i kroppen, således gav klar transmission elektron mikroskop observationer af insekt sensilla ultrastrukturer. Det næste skridt i dette præparat var bestemmelse af placeringen af insekt sensilla i prøven indlejret i harpiksblokken ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at øge præcisionen af mål sensilla positionering. Denne forbedrede udskæringnøjagtighed.
Introduction
Scanning elektron mikroskopi er et vigtigt redskab i mange morfologi undersøgelser, at SEM viser overfladestrukturer1,2. Transmission elektron mikroskopi appel er, at det kan bruges til at studere en bred vifte af biologiske strukturer på nanometer skalaen, fra arkitekturen af celler og ultrastruktur af organeller, til strukturen af makromolekylære komplekser og proteiner. TEM viser indre strukturer3,4,5.
Coleoptera er den største gruppe af insekter, herunder omkring 182 familier og 350.000 arter. De fleste af de coleopteran insekter, især træboring bille, foder på planter, hvoraf mange er vigtige skadedyr af skove og frugttræer, forårsager ødelæggende skader på træer6. På nuværende tidspunkt har forebyggelse og bekæmpelse af population af skadedyr baseret på kemisk økologi teori fået stigende opmærksomhed7. Effektive, lavgiftige, forureningsfrie feromonkontrolmetoder er blevet en effektiv måde8. Undersøgelse af sensilla morfologi og ultrastruktur af insekter er en vigtig del af insekt kemisk økologi forskning. Scanningog transmission elektron mikroskopi (SEM og TEM, henholdsvis) bruges med stor effekt til at studere deres morfologi og interne anatomi. Under tilberedningen af insektprøver til elektronmikroskopi (EM) kan observationsstedets objektivitet og ægthed dogpåvirkes 9. Generelt kræver fremstilling af SEM-prøve af insekter rengøring, vævsfiksering, dehydrering, metastese, tørring og sputter-belægning10. På grund af det komplekse miljø, hvor træborebille lever, kroppens overflade ofte har forskellige forurenende stoffer og deres vedhæng ofte har mange fine lange sensilla eller børster. Især er nogle træborere ikke tilgængelige fra laboratorieforøgelse, som indsamles direkte i marken, og derefter sættes i fastgørelsesvæske for at sikre friskhed og efterfølgende vasket i laboratoriet. Hvis prøven først er fast og derefter vasket, naturligvis er det meget vanskeligere at fjerne snavs, fordi glutaraldehyd kraftigt løser det til prøven. Tween 20 er et overfladeaktivt11,12,13,14, som spiller en vigtig rolle i vasken, herunder at reducere overfladespændingen af vand og forbedre vådheden af vand på overfladen af vasketøjet. I denne undersøgelse blev Tween 20 tilføjet til fastgørelsesopløsningen og PBS rengøringsopløsningen for at reducere væskens overfladespænding og forhindre snavsi at deponere på borebillens karrosserioverflade, hvilket gjorde kroppens overflade renere i SEM.
Ved hjælp af TEM, sensilla på forskellige organer af insekter kan skæres til at afsløre de klare strukturer inde i dem, hvilket giver et grundlag for at analysere sensilla funktioner. Når emnet insekt, såsom træborebille, er stor, og dens krop væg har en betydelig grad af skleroficering, så fiksativ kan ikke fuldt mætte organvæv inde i insektkroppen. Tween 20 kan forbedre spredningog suspension kapacitet af snavs. I denne undersøgelse, Tween 20 blev tilføjet til fiksativ at forbedre fiksativ væske indtrængning i insektlegeme væggen af træborebille, undgå deformation og sammenbrud af epidermi11,12,13. Hertil kommer, ved hjælp af generelle udskæring teknologi, er det vanskeligt præcist at finde forskellige typer af sensilla, især for nogle små sensilla15. Baseret på traditionelle TEM prøve forberedelse, denne undersøgelse kombineret fluorescens mikroskopi og SEM at bestemme placeringen af insekt sensilla i indlejret blok, og dermed forbedre udskæring nøjagtighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenterede vi en prøve forberedelse sordning for scanning og transmission elektron mikroskopi for træborebille. Ved hjælp af insektvedhæng som et repræsentativt studieemne viste vi flere forbedringer i forhold til traditionelle prøvepræparatmetoder.
Den flydende olie, der adskilles fra den faste overflade, emulgeres til små dråber, som kan spredes godt og suspenderes i vaskemediet for at reducere gendeponeringpå objektets overflade. Vask ydeevne overfladeaktive omf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter pris på den generøse bistand fra Beijing Vocational College of Agriculture, Institut for Anvendelse af Atomenergi (Kinesisk Academy of Agricultural Science), Bioresearch Center i Beijing Skovbrug University og professor Shan-gan Zhang fra Institut for Zoologi, Kinesisk Videnskabsakademi. Denne forskning blev støttet af National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Skovvidenskabelig forskning i Kinas offentlige velfærd (201504304), Indre Mongoliet Agricultural University High-level Talent Research Startup Plan (203206038), og Indre Mongoliet autonome region videregående uddannelse Forskningsprojekt (NJZZ18047), Indre Mongoliet autonome region Linxue “Double First-class” Construction Project (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. . Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , 1 (2003).
