Denne protokol beskriver induktion af pulmonal hypertension (PH) i mus baseret på eksponering for hypoxi og injektion af en VEGF receptor antagonist. Dyrene udvikler PH og højre ventrikel (RV) hypertrofi 3 uger efter indledningen af protokollen. Den funktionelle og morfometriske karakterisering af modellen præsenteres også.
Pulmonal hypertension (PH) er en patofysiologisk tilstand, defineret ved et gennemsnitligt lungearterialtryk på over 25 mm Hg i hvile, vurderet ved højre hjertekateterisation. Et bredt spektrum af sygdomme kan føre til PH, forskellige i deres ætiologi, histopatologi, klinisk præsentation, prognose, og respons på behandling. Trods betydelige fremskridt i de seneste år er PH fortsat en uhærdet sygdom. Forståelse af de underliggende mekanismer kan bane vejen for udviklingen af nye behandlingsformer. Dyremodeller er vigtige forskningsværktøjer til at nå dette mål. I øjeblikket er der flere modeller til rådighed for recapitulating PH. Denne protokol beskriver en to-hit mus PH model. Stimuli for PH udvikling er hypoxi og injektion af SU5416, en vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) receptor antagonist. Tre uger efter indledningen af Hypoxi/SU5416 udvikler dyrene lunge-vaskulær remodellering, der efterligner de histopatologiske forandringer, der er observeret i human PH (overvejende gruppe 1). Vaskulær remodeling i lungecirkulationen resulterer i remodeling af højre hjertekammer (RV). Procedurerne for måling af RV-tryk (ved hjælp af den åbne brystmetode), de morfometriske analyser af RV (ved dissekere og vejning af både hjertesektriker) og de histologiske vurderinger af remodelleringen (både pulmonal ved at vurdere vaskulær remodellering og hjertebåren ved at vurdere RV-kardiomyocythypertrofi og fibrose) beskrives i detaljer. Fordelene ved denne protokol er muligheden for anvendelse både i vild type og i genetisk modificerede mus, den relativt nemme og billige gennemførelse, og den hurtige udvikling af den sygdom af interesse (3 uger). Begrænsninger af denne metode er, at mus ikke udvikler en alvorlig fænotype og PH er reversibel ved tilbagevenden til normoxia. Forebyggelse, samt terapi undersøgelser, kan nemt gennemføres i denne model, uden at det er nødvendigt at avancerede færdigheder (i modsætning til kirurgisk gnaver modeller).
Pulmonal hypertension (PH) er en patofysiologisk tilstand, defineret ved et gennemsnitligt lungearterial (PA) tryk på over 25 mm Hg i hvile, vurderet ved højre hjertekateterisation1,2. Der er en række sygdomme, der kan føre til PH. I et forsøg på at organisere de PH-tilknyttede forhold er der udviklet flere klassifikationssystemer. Den nuværende kliniske klassificering kategoriserer de mange PH-relaterede sygdomme i 5 forskellige grupper1. Denne skelnen er vigtig, da forskellige grupper af patienter har sygdomme, der adskiller sig i deres kliniske præsentation, patologi, prognose og respons på behandling2. Tabel 1 opsummerer den nuværende klassificering suppleret med de grundlæggende histopatologiske egenskaber ved hver sygdom.
Tabel 1: Oversigt over den kliniske klassificering af PH samt de vigtigste histopatologiske træk i grupperne. Egnethed af Hypoxi/SU5416-protokollen til modellering af PH. Denne tabel er blevet ændret fra19. PH: Pulmonal hypertension, PAH: Pulmonal arteriel hypertension
Trods betydelige fremskridt i behandlingen af PH-relaterede sygdomme, PH stadig uden en kur, med en 3-årig dødelighed spænder mellem 20% og 80%3. Dette indikerer det bydende nødvendigt behov for at forstå de underliggende mekanismer i PH og derefter udviklingen af nye behandlingsformer for at forebygge, bremse progression, og helbrede sygdommen. Dyremodeller er af afgørende betydning for dette anvendelsesområde. I øjeblikket findes der forskellige modeller til at studere PH. Den interesserede læser er henvist til de fremragende anmeldelser om dette emne2,,3,4. I betragtning af de mange forskellige sygdomme, der fører til PH, er det indlysende, at de forskellige forhold i human PH ikke kan perfekt opsummeres i én dyremodel. De tilgængelige dyremodeller kan kategoriseres i i) single-hit, ii) to-hit, iii) knockout, og iv) overexpression modeller3. I single-hit modeller, er PH induceret af en enkelt patologisk stimulus, mens to-hit modeller kombinerer to patologiske stimuli med det mål at fremkalde mere alvorlige PH og dermed tættere efterligne den komplekse menneskelige sygdom. Ud over de ætiologiske forskelle resulterer de mange stimuli i PH-modelleringsforskelle, der også afhænger af dyrenes art og genetiske baggrund4.
En af de mest almindeligt anvendte klassiske PH gnaver modeller er den kroniske hypoxi model2. Hypoxi er kendt for at fremkalde PH hos mennesker såvel som hos flere dyrearter. Hypoxi har den fordel, at det er en fysiologisk stimulus for PH (Tabel 1). Men, mens graden af hypoxi anvendes til inducerende PH i gnavere er langt mere alvorlig end hos mennesker, den enkelte fornærmelse (hypoxi) fører kun til en mild form for vaskulær remodeling. Dette efterligner ikke sværhedsgraden af den menneskelige sygdom. Tilføjelsen af en anden-hit, en ekstra stimulus for at fremkalde PH, viste lovende resultater: injektion af forbindelsen SU5416 til gnavere kombineret med hypoxisk stimulus inducerer en mere alvorlig PH fænotype2,,5,6. SU5416 er en hæmmer af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) receptor-2. Det blokerer VEGF receptorer og fører til endotelcelle apoptose. Under hypoxiske tilstande stimulerer dette udbredelsen af en delmængde af apoptoseresistente endotelceller. Desuden fører SU5416 til glat muskelcelleproliferedning. Kombinationen af disse effekter resulterer i patologisk vaskulær remodeling af lungecirkulationen og fører til forhøjet PA tryk og højre ventrikulære remodeling2,5,7. Modellen blev først beskrevet hos rotter6 og senere anvendt på mus4,5,7. Musemodellen udviser mindre svær vaskulær remodeling sammenlignet med rotter. Desuden fortsætter PH, når den vender tilbage til normoxia, med at udvikle sig i rotter, mens det hos mus er delvist reversibelt.
Følgende protokol beskriver alle trin til modellering af PH i mus ved hjælp af metoden Hypoxia/SU5416 (planlægning, tidslinje, udførelse). Derudover er karakteriseringen af modellen beskrevet i denne protokol: funktionelt (ved invasivt måling af højre ventrikeltryk (RV) ved hjælp af den åbne brystteknik), morfemetrisk (ved dissekting og vejning af både højre og venstre ventrikler) samt histologisk (ved at evaluere lungevaskulær remodeling, højre ventrikelmyocyt hypertrofi og fibrose).
Alle de trin og metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan nemt implementeres af efterforskere på ethvert oplevelsesniveau. Mens de funktionelle målinger af RV ved hjælp af det åbne bryst teknik (beskrevet her) er ikke guld standard metode i marken, det har den fordel, at det hurtigt kan læres og præcist gengives selv af en mindre erfaren eksperimentator.
Denne protokol beskriver, hvordan man model PH i mus ved at kombinere to patologiske stimuli: kronisk hypoxi og SU5416 injektion (Hypoxi/SU5416)18. I et forsøg på at korrelere denne musemodel med den menneskelige PH tilstand, man uundgåeligt skal se på den nuværende PH klassificering, vist i tabel 1. PH i næsten alle former er karakteriseret ved lunge vasokonstriktion og afvigende spredning af endotel og glatte muskelceller. Dette fører til forhøjet tryk i lungearterierne …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association (AHA- 17SDG3370112 og 18IPA34170258) og fra National Institutes of Health NIH K01 HL135474 til Y.S. O.B blev støttet af Deutsche Herzstiftung.
Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
Connection tubing and valves | |||
Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
Dry ice | |||
Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
OCT | Tissue Tek | 4583 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
Toluol | Roth | 9558.3 | |
Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
Xylene | Roth |