Induktion og karakterisering af pulmonal hypertension hos mus ved hjælp af Hypoxi/SU5416-modellen

Summary

Denne protokol beskriver induktion af pulmonal hypertension (PH) i mus baseret på eksponering for hypoxi og injektion af en VEGF receptor antagonist. Dyrene udvikler PH og højre ventrikel (RV) hypertrofi 3 uger efter indledningen af protokollen. Den funktionelle og morfometriske karakterisering af modellen præsenteres også.

Abstract

Pulmonal hypertension (PH) er en patofysiologisk tilstand, defineret ved et gennemsnitligt lungearterialtryk på over 25 mm Hg i hvile, vurderet ved højre hjertekateterisation. Et bredt spektrum af sygdomme kan føre til PH, forskellige i deres ætiologi, histopatologi, klinisk præsentation, prognose, og respons på behandling. Trods betydelige fremskridt i de seneste år er PH fortsat en uhærdet sygdom. Forståelse af de underliggende mekanismer kan bane vejen for udviklingen af nye behandlingsformer. Dyremodeller er vigtige forskningsværktøjer til at nå dette mål. I øjeblikket er der flere modeller til rådighed for recapitulating PH. Denne protokol beskriver en to-hit mus PH model. Stimuli for PH udvikling er hypoxi og injektion af SU5416, en vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) receptor antagonist. Tre uger efter indledningen af Hypoxi/SU5416 udvikler dyrene lunge-vaskulær remodellering, der efterligner de histopatologiske forandringer, der er observeret i human PH (overvejende gruppe 1). Vaskulær remodeling i lungecirkulationen resulterer i remodeling af højre hjertekammer (RV). Procedurerne for måling af RV-tryk (ved hjælp af den åbne brystmetode), de morfometriske analyser af RV (ved dissekere og vejning af både hjertesektriker) og de histologiske vurderinger af remodelleringen (både pulmonal ved at vurdere vaskulær remodellering og hjertebåren ved at vurdere RV-kardiomyocythypertrofi og fibrose) beskrives i detaljer. Fordelene ved denne protokol er muligheden for anvendelse både i vild type og i genetisk modificerede mus, den relativt nemme og billige gennemførelse, og den hurtige udvikling af den sygdom af interesse (3 uger). Begrænsninger af denne metode er, at mus ikke udvikler en alvorlig fænotype og PH er reversibel ved tilbagevenden til normoxia. Forebyggelse, samt terapi undersøgelser, kan nemt gennemføres i denne model, uden at det er nødvendigt at avancerede færdigheder (i modsætning til kirurgisk gnaver modeller).

Introduction

Pulmonal hypertension (PH) er en patofysiologisk tilstand, defineret ved et gennemsnitligt lungearterial (PA) tryk på over 25 mm Hg i hvile, vurderet ved højre hjertekateterisation^1,2. Der er en række sygdomme, der kan føre til PH. I et forsøg på at organisere de PH-tilknyttede forhold er der udviklet flere klassifikationssystemer. Den nuværende kliniske klassificering kategoriserer de mange PH-relaterede sygdomme i 5 forskellige grupper¹. Denne skelnen er vigtig, da forskellige grupper af patienter har sygdomme, der adskiller sig i deres kliniske præsentation, patologi, prognose og respons på behandling². Tabel 1 opsummerer den nuværende klassificering suppleret med de grundlæggende histopatologiske egenskaber ved hver sygdom.

Tabel 1: Oversigt over den kliniske klassificering af PH samt de vigtigste histopatologiske træk i grupperne. Egnethed af Hypoxi/SU5416-protokollen til modellering af PH. Denne tabel er blevet ændret fra¹⁹. PH: Pulmonal hypertension, PAH: Pulmonal arteriel hypertension

Trods betydelige fremskridt i behandlingen af PH-relaterede sygdomme, PH stadig uden en kur, med en 3-årig dødelighed spænder mellem 20% og 80%³. Dette indikerer det bydende nødvendigt behov for at forstå de underliggende mekanismer i PH og derefter udviklingen af nye behandlingsformer for at forebygge, bremse progression, og helbrede sygdommen. Dyremodeller er af afgørende betydning for dette anvendelsesområde. I øjeblikket findes der forskellige modeller til at studere PH. Den interesserede læser er henvist til de fremragende anmeldelser om dette emne^2,,3,4. I betragtning af de mange forskellige sygdomme, der fører til PH, er det indlysende, at de forskellige forhold i human PH ikke kan perfekt opsummeres i én dyremodel. De tilgængelige dyremodeller kan kategoriseres i i) single-hit, ii) to-hit, iii) knockout, og iv) overexpression modeller³. I single-hit modeller, er PH induceret af en enkelt patologisk stimulus, mens to-hit modeller kombinerer to patologiske stimuli med det mål at fremkalde mere alvorlige PH og dermed tættere efterligne den komplekse menneskelige sygdom. Ud over de ætiologiske forskelle resulterer de mange stimuli i PH-modelleringsforskelle, der også afhænger af dyrenes art og genetiske baggrund⁴.

En af de mest almindeligt anvendte klassiske PH gnaver modeller er den kroniske hypoxi model². Hypoxi er kendt for at fremkalde PH hos mennesker såvel som hos flere dyrearter. Hypoxi har den fordel, at det er en fysiologisk stimulus for PH (Tabel 1). Men, mens graden af hypoxi anvendes til inducerende PH i gnavere er langt mere alvorlig end hos mennesker, den enkelte fornærmelse (hypoxi) fører kun til en mild form for vaskulær remodeling. Dette efterligner ikke sværhedsgraden af den menneskelige sygdom. Tilføjelsen af en anden-hit, en ekstra stimulus for at fremkalde PH, viste lovende resultater: injektion af forbindelsen SU5416 til gnavere kombineret med hypoxisk stimulus inducerer en mere alvorlig PH fænotype^2,,5,6. SU5416 er en hæmmer af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) receptor-2. Det blokerer VEGF receptorer og fører til endotelcelle apoptose. Under hypoxiske tilstande stimulerer dette udbredelsen af en delmængde af apoptoseresistente endotelceller. Desuden fører SU5416 til glat muskelcelleproliferedning. Kombinationen af disse effekter resulterer i patologisk vaskulær remodeling af lungecirkulationen og fører til forhøjet PA tryk og højre ventrikulære remodeling^2,5,7. Modellen blev først beskrevet hos rotter^{6 og} senere anvendt på mus^4,5,7. Musemodellen udviser mindre svær vaskulær remodeling sammenlignet med rotter. Desuden fortsætter PH, når den vender tilbage til normoxia, med at udvikle sig i rotter, mens det hos mus er delvist reversibelt.

Følgende protokol beskriver alle trin til modellering af PH i mus ved hjælp af metoden Hypoxia/SU5416 (planlægning, tidslinje, udførelse). Derudover er karakteriseringen af modellen beskrevet i denne protokol: funktionelt (ved invasivt måling af højre ventrikeltryk (RV) ved hjælp af den åbne brystteknik), morfemetrisk (ved dissekting og vejning af både højre og venstre ventrikler) samt histologisk (ved at evaluere lungevaskulær remodeling, højre ventrikelmyocyt hypertrofi og fibrose).

Alle de trin og metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan nemt implementeres af efterforskere på ethvert oplevelsesniveau. Mens de funktionelle målinger af RV ved hjælp af det åbne bryst teknik (beskrevet her) er ikke guld standard metode i marken, det har den fordel, at det hurtigt kan læres og præcist gengives selv af en mindre erfaren eksperimentator.

Protocol

Forud for eventuelle dyreforsøg opnå den lokale institutionelle dyrepleje udvalg tilladelse. De nuværende eksperimenter blev udført efter godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Icahn School of Medicine på Mount Sinai. 1. PH induktion Under forberedelse Før du begynder undersøgelsen, omhyggeligt planlægge det eksperimentelle design. Sørg for, at mus udsættes for hypoxi på samme tidspunkt som den første SU5416-injektion. Et eksempel p…

Representative Results

I denne protokol beskriver vi i detaljer oprettelsen af Hypoxia/SU5416-modellen til at fremkalde PH i mus. Desuden beskriver vi alle de nødvendige trin til at udføre lungevaskulær og hjerteevaluering ved observationsperiodens afslutning. En oversigt over forsøgsdesignet for denne model findes i figur 1A13,14. Mus udsættes for normobarisk hypoxi (10% O2) og injiceres subkuti…

Discussion

Denne protokol beskriver, hvordan man model PH i mus ved at kombinere to patologiske stimuli: kronisk hypoxi og SU5416 injektion (Hypoxi/SU5416)¹⁸. I et forsøg på at korrelere denne musemodel med den menneskelige PH tilstand, man uundgåeligt skal se på den nuværende PH klassificering, vist i tabel 1. PH i næsten alle former er karakteriseret ved lunge vasokonstriktion og afvigende spredning af endotel og glatte muskelceller. Dette fører til forhøjet tryk i lungearterierne …

Materials

Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth