हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल का उपयोग कर चूहों में फेफड़े के उच्च रक्तचाप का प्रेरण और लक्षण वर्णन
Summary
यह प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया के संपर्क में आने और वीजीएफ रिसेप्टर विरोधी के इंजेक्शन के आधार पर चूहों में फेफड़े के उच्च रक्तचाप (पीएच) के शामिल होने का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल की शुरुआत के 3 सप्ताह बाद जानवर पीएच और राइट वेंट्रिकुलर (आरवी) हाइपरट्रॉफी विकसित करते हैं। मॉडल का कार्यात्मक और मॉर्फोमेट्रिकल लक्षण वर्णन भी प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
पल्मोनरी हाइपरटेंशन (पीएच) एक रोगविज्ञानी स्थिति है, जो एक मतलब पल्मोनरी धमनी दबाव द्वारा परिभाषित किया गया है जो बाकी में 25 मिमी एचजी से अधिक है, जैसा कि सही हृदय कैथेटराइजेशन द्वारा मूल्यांकन किया गया है। बीमारियों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम पीएच का कारण बन सकता है, उनके एटियोलॉजी, हिस्टोपैथोलॉजी, नैदानिक प्रस्तुति, पूर्वानुमान और उपचार के जवाब में भिन्न हो सकता है। पिछले वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, पीएच एक असुरक्षित बीमारी बनी हुई है । अंतर्निहित तंत्र को समझना नए उपचारों के विकास का मार्ग प्रशस्त कर सकता है । पशु मॉडल इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण हैं। वर्तमान में, पीएच के पुनर्मूल्यांकन के लिए कई मॉडल उपलब्ध हैं। यह प्रोटोकॉल दो हिट माउस पीएच मॉडल का वर्णन करता है। पीएच विकास के लिए उत्तेजनाएं हाइपोक्सिया और SU5416 का इंजेक्शन, एक संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) रिसेप्टर विरोधी हैं। हाइपोक्सिया/SU5416 की दीक्षा के तीन सप्ताह बाद, जानवरों ने मानव पीएच (मुख्य रूप से समूह 1) में मनाए गए हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों की नकल करते हुए फेफड़े के संवहनी पुनर्मॉडलिंग का विकास किया । पल्मोनरी सर्कुलेशन में वैस्कुलर रीमॉडलिंग के परिणामस्वरूप सही वेंट्रिकल (आरवी) की रीमॉडलिंग होती है। आरवी दबाव (खुली छाती विधि का उपयोग करके), आरवी के रूपोमेट्रिकल विश्लेषण (हृदय वेंट्रिकल्स दोनों को विच्छेदन और वजन से) और रीमॉडलिंग के हिस्टोलॉजिकल आकलन (आरवी कार्डियोमायोसाइट हाइपरट्रॉफी और फाइब्रोसिस का आकलन करके संवहनी रिमॉडलिंग और कार्डियक का आकलन करके दोनों पल्मोनरी) के बारे में विस्तार से वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल के फायदे जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, अपेक्षाकृत आसान और कम लागत वाले कार्यान्वयन, और ब्याज की बीमारी (3 सप्ताह) दोनों में आवेदन की संभावना है। इस विधि की सीमाएं यह हैं कि चूहों एक गंभीर फेनोटाइप विकसित नहीं करते हैं और पीएच नॉर्मोक्सिया में लौटने पर उलटा होता है। रोकथाम, साथ ही चिकित्सा अध्ययन, उन्नत कौशल की आवश्यकता के बिना इस मॉडल में आसानी से लागू किया जा सकता है (सर्जिकल कृंतक मॉडल के विपरीत)।
Introduction
पल्मोनरी हाइपरटेंशन (पीएच) एक रोगविज्ञानी स्थिति है, जो एक मतलब पल्मोनरी धमनी (पीए) दबाव द्वारा परिभाषित किया गया है, जो बाकी में 25 मिमी एचजी से अधिक है, जैसा कि सही हृदय कैथेटराइजेशन1,,2द्वारा मूल्यांकन किया गया है। कई तरह की बीमारियां होती हैं जो पीएच का कारण बन सकती हैं। पीएच से जुड़ी स्थितियों को व्यवस्थित करने के प्रयास में, कई वर्गीकरण प्रणालियां विकसित की गई हैं। वर्तमान नैदानिक वर्गीकरण 5 विभिन्न समूहों में कई पीएच से जुड़े रोगों को वर्गीकृत करता है1। यह अंतर महत्वपूर्ण है क्योंकि रोगियों के विभिन्न समूहों में ऐसी बीमारियां होती हैं जो उनकी नैदानिक प्रस्तुति, पैथोलॉजी, पूर्वानुमान और उपचार के प्रति प्रतिक्रियामेंभिन्न होती हैं। तालिका 1 वर्तमान वर्गीकरण को संक्षेप में प्रस्तुत करता है, जो प्रत्येक रोग की बुनियादी हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के साथ पूरित होता है।
तालिका 1: समूहों के भीतर मुख्य हिस्टोपैथोलॉजिकल सुविधाओं के साथ पीएच के नैदानिक वर्गीकरण का अवलोकन। मॉडलिंग पीएच के लिए हाइपोक्सिया/SU5416 प्रोटोकॉल की उपयुक्तता । इस तालिका को19से संशोधित किया गया है । पीएच: फेफड़े उच्च रक्तचाप, पीएएच: पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप
पीएच से जुड़े रोगों के उपचार में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, पीएच अभी भी एक इलाज के बिना रहता है, एक 3 साल की मृत्यु दर के साथ 20% और ८०%3के बीच लेकर । यह पीएच के अंतर्निहित तंत्र को समझने की अनिवार्य आवश्यकता को इंगित करता है और उसके बाद, प्रगति को रोकने, धीमा करने और बीमारी का इलाज करने के लिए उपन्यास चिकित्सा के विकास को इंगित करता है। पशु मॉडल इस दायरे के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं । वर्तमान में, पीएच का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल मौजूद हैं। इच्छुक पाठक को इस विषय 2,3,4,पर उत्कृष्ट समीक्षाओं के लिए संदर्भित कियाजाताहै । पीएच की ओर जाने वाली बीमारियों की विविधता को ध्यान में रखते हुए, यह स्पष्ट है कि मानव पीएच की विविध स्थितियों को एक पशु मॉडल में पूरी तरह से पुन: प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता है। उपलब्ध पशु मॉडल ों को आई में वर्गीकृत किया जा सकता है) एकल हिट, ii) दो हिट, iii) नॉकआउट, और iv) ओवरएक्सप्रेशन मॉडल3. एकल हिट मॉडलों में, पीएच एक ही रोग उत्तेजना से प्रेरित है, जबकि दो हिट मॉडल अधिक गंभीर पीएच उत्प्रेरण के लक्ष्य के साथ दो रोग उत्तेजनाओं गठबंधन और इस तरह अधिक बारीकी से जटिल मानव रोग की नकल । एटियोलॉजिकल मतभेदों के अलावा, पीएच मॉडलिंग मतभेदों में कई उत्तेजनाओं के परिणामस्वरूप जो प्रजातियों और जानवरों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर भी निर्भर करता है4।
सबसे अधिक इस्तेमाल किया क्लासिक पीएच कृंतक मॉडल में से एक क्रोनिक हाइपोक्सिया मॉडल2है । हाइपोक्सिया मनुष्यों के साथ-साथ कई जानवरों की प्रजातियों में पीएच को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। हाइपोक्सिया को पीएच(टेबल 1)के लिए एक शारीरिक प्रोत्साहन होने का लाभ है। हालांकि, जबकि कृंतक में पीएच को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइपोक्सिया की डिग्री मनुष्यों की तुलना में बहुत अधिक गंभीर है, एकल अपमान (हाइपोक्सिया) केवल संवहनी रीमॉडलिंग के हल्के रूप की ओर जाता है। यह मानव रोग की गंभीरता की नकल नहीं करता है। पीएच को प्रेरित करने के लिए एक दूसरी हिट, एक अतिरिक्त उत्तेजना के अलावा, आशाजनक परिणाम दिखाए: हाइपोक्सिक उत्तेजना के साथ संयुक्त कृंतक को यौगिक SU5416 का इंजेक्शन एक अधिक गंभीर पीएच फेनोटाइप2,,5,,6प्रेरित करता है। SU5416 संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) रिसेप्टर-2 का अवरोधक है। यह वीजीएफ रिसेप्टर्स को ब्लॉक करता है और एंडोथेलियल सेल एपोप्टोसिस की ओर जाता है। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, यह एपोप्टोसिस प्रतिरोधी एंडोथेलियल कोशिकाओं के सबसेट के प्रसार को उत्तेजित करता है। इसके अलावा, SU5416 चिकनी मांसपेशियों की कोशिका प्रसार की ओर जाता है। इन प्रभावों के संयोग से फेफड़े के परिसंचरण की रोगात्मक संवहनी पुन: तैयार होती है और इससे पीए दबाव और दाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडलिंग2,5,7होताहै . इस मॉडल का वर्णन पहले चूहों में6 और बाद में चूहों पर 4,5,7से लगाया गया था .7 माउस मॉडल चूहों की तुलना में कम गंभीर संवहनी रीमॉडलिंग प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, जब नॉर्मोक्सिया में वापस आ जाता है, तो पीएच चूहों में प्रगति करता रहता है, जबकि चूहों में यह आंशिक रूप से प्रतिवर्ती होता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया/SU5416 विधि (योजना, समय रेखा, निष्पादन) का उपयोग कर चूहों में पीएच मॉडलिंग के लिए सभी चरणों का वर्णन करता है । इसके अतिरिक्त, मॉडल के लक्षण वर्णन को इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है: कार्यात्मक रूप से (खुले सीने की तकनीक का उपयोग करके सही वेंट्रिकुलर (आरवी) दबाव को आक्रामक रूप से मापकर), रूपांतर (दाएं और बाएं वेंट्रिकल्स दोनों को विच्छेदन और वजन करके), साथ ही हिस्टोलॉजिकल रूप से (पल्मोनरी वैस्कुलर रिमॉडलिंग, दाएं वेंट्रिक कार्डियोकुलेर हाइपरट्रॉफी और फाइब्रोसिस का मूल्यांकन करके)।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी कदमों और तरीकों को जांचकर्ताओं द्वारा किसी भी अनुभव स्तर पर आसानी से लागू किया जा सकता है। जबकि खुली छाती तकनीक का उपयोग करके आरवी के कार्यात्मक माप (यहां वर्णित) क्षेत्र में स्वर्ण मानक विधि नहीं है, इसका लाभ यह है कि इसे कम अनुभवी प्रयोगकर्ता द्वारा भी जल्दी से सीखा और सटीक रूप से पुन: पेश किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे दो रोग उत्तेजनाओं के संयोजन से चूहों में पीएच मॉडल के लिए: पुरानी हाइपोक्सिया और SU5416 इंजेक्शन (Hypoxia/SU5416)18। मानव पीएच स्थिति के साथ इस माउस मॉडल को सहसंबंधित करने के प्रया?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एएचए-17SDG33370112 और 18IPA34170258) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों NIH K01 HL135474 से Y.S. O.B को ड्यूश हर्ज़स्टिफ्टंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
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