Elektroforetisk levering af γ-aminosmørsyre (GABA) til epileptisk fokus forhindrer krampeanfald i mus
Summary
Udfordringen ved epilepsi forskning er at udvikle nye behandlinger for patienter, hvor klassisk terapi er utilstrækkelig. Ved hjælp af en ny protokol — ved hjælp af et implantabelt lægemiddel levering system — vi er i stand til at kontrollere anfald i bedøvet mus ved elektroforetisk levering af GABA i epileptiske fokus.
Abstract
Epilepsi er en gruppe af neurologiske lidelser, som påvirker millioner af mennesker i hele verden. Selv om behandling med medicin er nyttigt i 70% af tilfældene, alvorlige bivirkninger påvirker patienternes livskvalitet. Desuden er en høj procentdel af epileptiske patienter resistente over for lægemidler; i deres tilfælde, Neurokirurgi eller neurostimulation er nødvendige. Derfor er det vigtigste mål for epilepsi forskning at opdage nye terapier, som enten er i stand til at helbrede epilepsi uden bivirkninger eller forebygge tilbagevendende anfald hos lægemiddelresistente patienter. Neuro teknik giver nye tilgange ved at bruge nye strategier og teknologier til at finde bedre løsninger til at helbrede epileptiske patienter i fare.
Som en demonstration af en ny forsøgsprotokol i en akut musemodel af epilepsi anvendes et direkte in situ-elektroforetisk lægemiddel udbringningssystem. Nemlig en neurale sonde, der inkorporerer en mikrofluidic ion pumpe (μFIP) for on-demand lægemiddel levering og samtidig registrering af lokal neurale aktivitet implanteres og påvises at være i stand til at kontrollere 4-aminopyridin-induceret (4AP-induceret) beslaglæggelse-lignende hændelse (SLE). Den γ-aminosmørsyre (GABA) koncentrationen holdes i det fysiologiske område ved den præcise kontrol af GABA levering at nå frem til en antiepileptisk effekt i beslaglæggelse fokus, men ikke at forårsage over hæmning-induceret rebound brister. Metoden gør det muligt både påvisning af patologisk aktivitet og intervention for at stoppe anfald ved at levere hæmmende neurotransmittere direkte til epileptisk fokus med præcis spatiotemporal kontrol.
Som et resultat af udviklingen til den eksperimentelle metode, SLEs kan induceres i en meget lokaliseret måde, der giver beslaglæggelse kontrol af den præcist indstillede GABA levering på anfald debut.
Introduction
Epilepsi er den fjerde mest almindelige neurologiske lidelse: ca. 1% af befolkningen lider af epilepsi, og omkring en tredjedel af de berørte har tilbagevendende anfald. I de fleste tilfælde kan krampeanfald styres med medicin. Men, Drug behandling skal indstilles for hver patient individuelt, hvor korrekt dosering kan tage år at finde1,2. Derudover, de fleste af medicinen har alvorlige bivirkninger, der reducerer livskvaliteten3,4,5,6,7. Endelig, i 30% af tilfældene patienter er resistente over for medicin, og i tilfælde af en konstant enkelt anfald generator locus, kun reective Neurokirurgi kan dæmpe forekomsten af krampeanfald8. Derfor er et stort initiativ i moderne epilepsi forskning at opdage nye strategier, som kan forhindre tilbagevendende anfald hos patienter i risiko, og samtidig reducere behovet for stærke Drug terapier og invasive reektive operationer.
Epileptiske anfald opstår, når der er en ubalance i excitatoriske og hæmmende kredsløb enten i hele hjernen (generaliseret epilepsi) eller i en lokaliseret del af hjernen (fokal epilepsi), således at neuroner udledning i en unormal måde9 , 10 stk. , 11. antiepileptiske lægemidler kan optræde på to forskellige måder i forebyggelse af krampeanfald: enten faldende excitation eller øget hæmning12. Specifikt, de kan enten ændre den elektriske aktivitet af neuronale celler ved at påvirke Ionkanaler i cellemembranen13 eller handle på kemisk transmission mellem neuroner ved at påvirke den hæmmende neurotransmitter GABA eller excitatoriske glutamat i synapserne14,15. For nogle medikamenter, virkningsmåden er ukendt18. Også, Drug behandlinger har en kontinuerlig effekt på patienter og kan ikke tilpasse sig udbredelsen dynamik af anfald. Ideelt set ville narkotika med specifikke virkningsmekanismer handle på de underliggende epileptiske processer. En optimal behandling ville ikke røre hjernen interictally, men ville handle straks, når et anfald begynder at udvikle. I modsætning hertil, i alle tilfælde af epilepsi, medicin nu betyder en systematisk behandling, der påvirker hele hjernen og hele kroppen af patienten9.
Epileptiske anfald kan forekomme mange år efter den indledende fornærmelse, såsom hjernen traumer. Perioden mellem den indledende fornærmelse og forekomsten af de første spontane anfald er karakteriseret ved betydelige molekylære og cellulære reorganisationer, herunder neuronal død med forsvinden af neuronal netværksforbindelser og axonal sprouting/neosynaptogenesis med fremkomsten af nye forbindelser19,20,21. Når anfald bliver tilbagevendende, deres hyppighed og sværhedsgrad tendens til at stige, involverer mere hjernen regioner. Det er vigtigt at skelne mellem steder af anfald debut (epileptogene regioner) fra formering netværk, som reglerne for beslaglæggelse Genesis og formering kan afvige. Forskning udført på humane væv og eksperimentelle modeller af epilepsi har givet vigtige data vedrørende reorganisering af kredsløb og deres evne til at generere krampeanfald20,21,22, 23. det er imidlertid vanskeligt at afgøre, om disse reorganisationer er adaptiv respons, eller om de er kausalt relateret til epileptogenesis eller beslaglæggelse Genesis og formering12.
At lokalisere det epileptiske fokus og anvende antiepileptiske lægemidler lokalt er derfor en af de største udfordringer i den samtidige epilepsi forskning. Flere eksperimenter ved hjælp af animalske modeller af epilepsi og nogle kliniske undersøgelser havde til formål at finde udbrud af anfald og definere de underliggende mekanismer i hjernen24,25,26,27. Med henblik herpå har vi udviklet en ny forsøgsprotokol ved hjælp af 4ap-induceret epilepsi model28,29,30,31 i en akut mus forberedelse, som giver mulighed for præcis indsættelse af tre enheder i det givne område af hippocampus, hvor netværksaktivitet in vivo manipuleres på en meget lokaliseret måde. Lokaliseret 4AP injektion af en glas mikropipette hjælper med at inducere epileptiske SLEs i en lokaliseret plet i hippocampus, mens ved hjælp af den roman polymer-baserede μFIP sonde kontrol af beslaglæggelses aktiviteten opnås samtidig ved at optage neuronal elektrisk aktivitet med enhedens optagelsessteder. Hippocampal lokal felt aktivitet overvåges også med en multikanals silicium sonde i en lagspecifik måde i cortex og i hippocampus samtidig.
De nyligt opfandt μFIP sonder arbejde ved hjælp af en anvendt elektrisk felt til at skubbe ladede lægemidler lagret i en mikrofluidic kanal på tværs af en ionbytter membran (IEM) og ud til det omgivende væv (figur 1). IEM over transporterer selektivt kun én type ion (kation eller anion) og arbejder således på at begrænse både passiv diffusion i “slukket” tilstand og transport af modsætninger ladede arter fra det omgivende væv ind i anordningen. Det elektriske felt skabes efter behov ved at anvende en lille spænding (< 1 V) mellem kilde elektroden, som er intern i den mikrofluidiske kanal, og en målelektrode, som er udvendig for anordningen (i dette tilfælde hoved skruen på dyre modellen). Hastigheden af lægemiddel levering er proportional med den anvendte spænding og den målte strøm mellem kilde-og målelektroderne. Den præcise tunbarhed af narkotika levering er en af de primære fordele ved μFIP. En anden kritisk fordel, sammenlignet med Fluidic eller tryk-baserede narkotika Delivery systemer, er, at i μFIP er der kun en ubetydelig trykstigning på lægemidlet levering Outlet som stoffer leveres på tværs af IEM uden deres Carrier løsning.
Der er en lille mængde af passiv lækage af GABA, når μFIP er “off”, men dette blev fundet ikke at gennemføre SLEs. ΜFIP er skræddersyet efter konventionelle mikrofabrikations metoder, som vi rapporterede tidligere31.
Da en måde at forhindre tilbagevendende anfald er blokaden af nettet udledninger i begyndelsen eller endda før den første beslaglæggelse begivenhed, den præsenterede metode til at levere den hæmmende neurotransmitter GABA i epileptiske fokus har stor terapeutiske potentiale for beslaglæggelse kontrol hos patienter med fokal epilepsi. Da GABA er en endogene substrat, det efterlader iboende neuronal egenskaber uændret i fysiologiske koncentrationer. Den lokale anvendelse af lave niveauer af GABA vil kun påvirke celler naturligt lydhør over for hæmning, og vil kun forårsage lignende effekter til fysiologiske hæmning, i modsætning til dyb hjerne stimulation (DBS), som har uspecifikke handlinger ved at stimulere alle celler af neuronal netværk i sit miljø, forårsager en blandet respons involverer både excitation og hæmning. Konklusionen er, at den foreslåede metode giver en mere specifik tilgang til beslaglæggelse kontrol end DBS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved at udvikle en ny forsøgsprotokol i en akut musemodel af epilepsi, kunne SLEs med succes styres ved hjælp af en μFIP implanteret i det epileptiske fokus. Takket være sin evne til at levere GABA med tidsmæssig og rumlig præcision, 4AP-induceret SLEs blev kontrolleret ved begyndelsen af anfald. Behandling af epilepsi er teoretisk muligt, hvis kontrollen af de neurale netværk udledninger er opnået på stedet for beslaglæggelse start. Den præsenterede protokol viste sig at være muligt, hvis lokalisering af den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M.P. anerkender støtte fra et Whitaker International Scholar-stipendium administreret af Institut for international uddannelse. A.K. blev sponsoreret af Marie Curie IEF (nr. 625372). A.W. anerkender finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under eu’s Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 716867). A.W. anerkender desuden Excellence-initiativet fra Aix-Marseille Universitet-A * MIDEX, et fransk “Investissements d’Avenir”-program. Forfatterne anerkender Dr. ilke Uguz, Dr. Sahika Inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro, og Zsófia Maglóczky for deres deltagelse i frugtbare diskussioner.
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15 (2018).
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
