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Methodenartikel

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

8.3K Aufrufe

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DOI:

10.3791/59270

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21. März 2019

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In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für eine orale Verabreichung Modell mit Galleria Mellonella Larven und wie prägen angeborene Immunantwort induziert. Unter Verwendung dieses Protokolls, werden Forscher ohne praktische Erfahrung der G. Mellonella Zwangsfütterung Methode verwenden können.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der immunogenen Potenzial der Kommensalen Bakterien auf das Immunsystem des Wirts ist ein wesentlicher Bestandteil, wenn Darm Host-Mikroben-Interaktionen zu studieren. Es ist allgemein bekannt, dass verschiedene Kommensalen ein unterschiedliches Potenzial zeigen, das intestinale Immunsystem des Wirts zu stimulieren. Diese Untersuchungen beinhalten Wirbeltiere, insbesondere Nagetiere. Da zunehmende ethische Bedenken mit Experimente mit Wirbeltieren verknüpft sind, gibt es eine hohe Nachfrage nach Wirbellosen Ersatz-Modellen.

Hier bieten wir ein Galleria Mellonella orale Verabreichung Modell mithilfe von Kommensalen nicht-pathogenen Bakterien und mögliche Einschätzung der immunogenen Potenzial der Kommensalen auf das Immunsystem G. Mellonella . Wir zeigen, dass G. Mellonella ist eine nützliche alternative Wirbellosen Ersatz-Modell, das ermöglicht die Analyse von Kommensalen mit verschiedenen immunogen Potenzial wie Bacteroides Vulgatus und Escherichia coli. Interessanterweise ausgestellt die Bakterien keine abtötende Wirkung auf die Larven, die ist ähnlich wie bei Säugetieren. Die Immunantwort von G. Mellonella waren vergleichbar mit fest gefügten angeborenen Immunantwort und Anerkennung der Bakterien und Produktion antimikrobielle Moleküle. Wir schlagen vor, dass G. Mellonella in der Lage war, frühere Mikrobiota Gleichgewicht wiederherzustellen, die aus gesunden Säugetieren bekannt ist. Obwohl vergleichbare angeborene Immunantwort in G. Mellonella und Wirbeltieren zu bieten, G. Mellonella keiner adaptiven Immunsystems Hafen. Da die untersuchten Komponenten des angeborenen Immunsystems evolutionären konserviert sind, kann das Modell eine Vorsortierung und erste Analyse der bakteriellen immunogenen Eigenschaften.

Einleitung

Der Darm Microbiome ist ein wesentlicher Bestandteil zur Aufrechterhaltung der Homöostase und beinhaltet sowohl angeborene und adaptive Immunantworten1,2. Die Kommensale Mikrobiota Gemeinschaft zeichnet sich durch verschiedene Kommensale Hauptbestandteile: Symbionten, die wohltuende Wirkung von wichtigen immunmodulatorischen Funktionen und Pathobionts, auf die negativen Auswirkungen können genetisch prädisponiert zu verleihen beherbergt, zu fördern und auslösen Darmentzündung3,4. Viele Studien über Symbionten und Pathobionts und deren Einfluss auf das ....

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Protokoll

1. G. Mellonella Aufzucht und Vorbereitung der Larven für die Experimente

Hinweis: Der Zyklus vom Ei bis zum letzten Larve instar dauert ca. 5-6 Wochen.

  1. Die Eier von Erwachsenen Motten 2 L Kisten mit Wachsmotten Substrat (22 % Mais Grütze, 22 % Weizenmehl, 17,5 % Bienenwachs, 11 % Magermilchpulver, 11 % Honig, 11 % Glycerin, 5,5 % getrocknete Hefe) zu übertragen. Führen Sie die gesamte Zucht bei 30 ° C im Dunkeln.
  2. Übertragen Sie 25 g des Substrats mit den Larven in frisches Substrat nach ca. 1-2 Wochen als kleine und winzige Larven sichtbar waren. Synchronisieren Sie die Larven nach 2 Wochen nach ihrer Größe und....

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Ergebnisse

Die Hämolymphe Infektionsmodell G. Mellonella in allgemein verwendet, die Virulenzfaktoren von einer Vielzahl von Krankheitserregern zu analysieren. Die meisten Messungen umfassen die Analyse der Sterblichkeit der Larven, ist eine ganz einfache Methode. Dennoch ist diese Methode nicht Rückschlüsse über Immunantworten im allgemeinen und die Ergebnisse von G. Mellonella Immunantworten mit vertebrate Abwehrmechanismen zu verknüpfen. Die G. Mellonella orale Verabrei.......

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Diskussion

G. Mellonella -Modell ist eine häufig verwendete bakterielle Virulenzfaktoren in einer systemischen Infektion Ansatz21zu beurteilen. Da viele Krankheitserreger und Bakterien die Gastgeber über die mündlichen Kolonisation oder Infektion Route eingeben, müssen neue Erkenntnisse gefunden werden, um G. Mellonella als Modell für die mündliche Kolonisation und Infektion zu bewerten.

Die Möglichkeit, hinten G. Mellonella zwischen 15-37 ° C ist ein gr.......

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der DFG (SPP1656), das DFG-Graduiertenkolleg 1708, der Bundesministeriums Für Bildung Und Forschung (BMBF) und das Deutsche Zentrum für Infektion Forschung (DZIF) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL RöhrchenEppendorf0030120086
100 bp DNA-Leiter Thermo Fisher Scientific15628019
1-Brom-3-Chlorpropan (BCP)Sigma-AldrichB9673
2 mL RöhrchenEppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033Colony PCR
50 mL RöhrchenGreiner Bio-One210 261
AgaroseBiozym840004
BienenwachsMixed-Store.de -
Gehirn Herz InfusionBrühe Thermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR KlonierungskitThermo Fisher ScientificK1232Klonierungsvektor für 16S Fragmente
MaisgrießOstermü hle Naturkost GmbH306Biologischer Anbau
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
DNA-freies DNA-Entfernungsset Thermo Fisher Scientific244510  Dnase-Aufschluss
TrockenhefeRapunzelnbsp;-Biologischer
Anbau Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14040
EthanolVWR20821.330
GlycerinSigma-AldrichW252506
HonigOstermü hle Naturkost GmbH487
Isopropanol VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IIRoche Molecular Systems5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, weißRoche Molecular Systems4729692001
Manuelle Mikrospritzenpumpe mit DigitalanzeigeWorld Precision InstrumentsDMP
Micro-Fine+ U-100 Insulinspritze 0,3 x 8 mmBecton Dickinson324826Mörtel zur oralen Verabreichung
, unglasiertVWR410-9327 
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
Nukleasefreies Wasser Thermo FisherScientific 10977035
Oxoid AnaeroGen Beutel Thermo Fisher ScientificAN0025AQualität und Menge von RNA
PCR StreifenBiozym710970
Stößel, unglasierte SchleifflächeVWR410-9324 
Phusion Korrektur lesen Enzym Thermo Fisher ScientificF553S
PrimerBiomere -
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR Kit Qiagen204056qPCR zur Messung der bakteriellen Kopienzahl
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit Qiagen204156qRT-PCR für Genexpressionsmessungen
QuantiTect Reverse Transkriptionskit Qiagen205311cDNA-Synthese
Qubit Assay-RöhrchenThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsHS DNA-Kit Thermo Fisher ScientificQ32851Quantifizierung von Plasmid- und cDNA-Proben
Qubit-FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226Quantifizierung von Plasmid- und cDNA-Proben
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Rnasin-Ribonuklease-HemmerPromegaN2511
MagermilchpulverSucofin -
SYBR safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
TRI Reagenz Sigma-AldrichT9424
WägeschiffchenVWR10803-148
WeizenmehlOstermü hle Naturkost GmbH6462Biologischer Anbau
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Referenzen

  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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