यहां, हम एक में विट्रो सह संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए आवर्ती चुनौती ट्यूमर-लक्षित टी कोशिकाओं, जो लक्षणप्ररूपी और कार्यात्मक एंटीट्यूमर टी सेल गतिविधि के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।
चिमेरिक antigen रिसेप्टर (कार) टी सेल थेरेपी के क्षेत्र तेजी से कार डिजाइन, जीन इंजीनियरिंग दृष्टिकोण और विनिर्माण अनुकूलन में सुधार के साथ आगे बढ़ रहा है । इन विकास के प्रयासों के लिए एक चुनौती है, तथापि, विट्रो assays में की स्थापना की है कि robustly vivo चिकित्सीय सफलता के लिए इष्टतम कार टी सेल उत्पादों के चयन को सूचित कर सकते हैं । मानक इन विट्रो ट्यूमर-lysis assays अक्सर के लिए कार टी कोशिकाओं के सच अर्बुदरोधी क्षमता अपेक्षाकृत कम सह संस्कृति समय और उच्च टी सेल ट्यूमर अनुपात करने के लिए कारण को प्रतिबिंबित करने में विफल । यहां, हम एक में विट्रो सह संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए उच्च ट्यूमर सेल लोड पर कार टी सेल आवर्ती हत्या की क्षमता का मूल्यांकन । इस परख में, लंबी अवधि साइटोटोक्सिक समारोह और कार टी कोशिकाओं के प्रफलन क्षमता अतिरिक्त ट्यूमर को सह संस्कृति हर दूसरे दिन के लिए प्रशासित लक्ष्यों के साथ 7 दिनों में विट्रो में जांच की है । इस परख की रूपरेखा टी सेल सक्रियकरण, थकावट और स्मृति phenotypes के साथ युग्मित किया जा सकता है । इस परख का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक सीडी 4 के बीच कार्यात्मक और लक्षणप्ररूपी मतभेदों को प्रतिष्ठित किया है+ और सीडी 8+ ग्लोब्लास्टोमा (gbm) कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं, vivo में उनके अंतर को दर्शाती है orthotopic में एंटीट्यूमर गतिविधि xenograft मॉडल । इस विधि कार टी सेल शक्ति का आकलन करने के लिए और विभिन्न कार टी सेल उत्पादों भर में कार्यात्मक विविधताओं को स्पष्ट करने के लिए एक सतही दृष्टिकोण प्रदान करता है ।
immunotherapy चिमेरिक antigen रिसेप्टर का उपयोग कर (कार)-इंजीनियर टी कोशिकाओं बी सेल द्रोह के खिलाफ आशाजनक परिणाम देखा है1,2,3,4, जबकि अन्य ट्यूमर को लक्षित करने की क्षमता 5,6,7के तहत कठोर जांच जारी है । महान प्रगति के लिए कार का निर्माण, विनिर्माण प्रक्रिया और रोगी पूर्व अर्क regimens6,7,8अनुकूलन किया गया है, और उपंयास सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण को बढ़ाने की उंमीद कर रहे है उनके हठ, सुरक्षा और ट्यूमर विशिष्टता9,10। हालांकि, यह मुश्किल है और श्रम-गहन उचित रूप से नैदानिक अनुवाद के लिए सबसे अच्छा विकल्प गाइड करने के लिए कार टी कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता का आकलन करने के लिए किया गया है । इस प्रकार अब तक कार टी सेल समारोह का मूल्यांकन करने के लिए सबसे स्थापित मॉडल immunoकी कमी मानव ट्यूमर xenografts असर चूहों में है, जिससे कार टी कोशिकाओं को एंटीट्यूमर प्रभावकारिता के लिए जांच कर रहे है और titrated सेल खुराक11,12 की तुलना में , 13 , 14 , 15. ये विवो में murine अध्ययन श्रम गहन और समय लेने वाली हैं, खासकर जब मापदंडों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग । इसके अलावा, विवो अध्ययनों में माउस उपभेदों, पशु देखभाल सुविधाओं और पशु-हैंडलिंग तकनीकों की पहुंच से रोका जा सकता है । इसलिए, एक की जरूरत है विट्रो में और अधिक सुविधाजनक विकसित करने के लिए effector गतिविधि के त्वरित readouts के लिए अनुमति assays, जो भी ईमानदारी से इन टी कोशिकाओं के vivo अर्बुदरोधी समारोह में प्रतिबिंबित.
विट्रो में टी कोशिकाओं के cytotoxicity निर्धारित करने के लिए पारंपरिक तरीकों degranulation का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया है, cytotoxicity उत्पादन और रेडियोआइसोटोप-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं (यानी, क्रोमियम रिहाई assays) लाइसे करने की क्षमता. हालांकि इन assays कार टी सेल विशिष्टता और निर्देशित लक्ष्य पहचान को परिभाषित करने के लिए जानकारीपूर्ण रहे हैं, वे अक्सर इंजीनियर टी कोशिकाओं12,13,16के vivo अर्बुदरोधी क्षमता में प्रतिबिंबित करने में विफल । कुछ मामलों में, लघु अवधि में विट्रो हत्या गतिविधि में vivo एंटीट्यूमर समारोह में16के साथ एक व्युत्क्रम सहसंबंध दिखाया । ऐसी विसंगति की संभावना उच्च effector का परिणाम है: लक्ष्य (e:t) इन विट्रो assays में इस्तेमाल किया अनुपात, और इसलिए कार टी सेल उत्पादों है कि17थकावट के लिए प्रवण हैं अंतर करने में असमर्थता. इसके विपरीत, वीवो ट्यूमर उन्मूलन टी कोशिकाओं के दौरान आम तौर पर बड़े ट्यूमर बोझ के खिलाफ प्रतिक्रिया, जिससे हत्या के कई दौर की आवश्यकता होती है और बाद में टी सेल भेदभाव और थकावट18,19, ड्राइविंग 20, जो कार टी कोशिकाओं12,13द्वारा प्रभावी ट्यूमर निकासी के खिलाफ प्रमुख बाधाओं में से एक है । इस बीच, सबसे अल्पकालिक विट्रो में हत्या assays भी टी सेल प्रसार में मतभेद readout नहीं है, जबकि कार टी सेल में रोगियों का इलाज कार टी सेल विस्तार के लिए क्षमता नैदानिक प्रतिक्रियाओं के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है4। इस प्रकार, विट्रो परख में उपयुक्त उच्च ट्यूमर बोझ, टी सेल थकावट के प्रेरण की शर्तों दोहराऊंगा की आवश्यकता होगी, और टी सेल विस्तार के readout के लिए अनुमति देता है ।
यहां हम एक रणनीति का वर्णन दोहराव ट्यूमर की हत्या क्षमता के लिए कार टी कोशिकाओं का मूल्यांकन, विट्रो सह में एक सरल संस्कृति परख के साथ । अलग टी सेल effector गतिविधि मापदंडों लक्ष्य सेल की हत्या, कार टी सेल विस्तार और स्मृति-या थकावट से जुड़े phenotypes सहित, एक साथ जांच की जा सकती है. इस परख से उत्पंन परिणाम कार टी कोशिकाओं के vivo अर्बुदरोधी प्रभाव में के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित है, और कार टी सेल उत्पादों की शक्ति का आकलन किया जा सकता है शोषण । जब तक हम एक परख का वर्णन करने के लिए प्राथमिक gbm लाइनों21के खिलाफ IL13Ra2-लक्षित कार टी कोशिकाओं का मूल्यांकन, यह आसानी से किसी भी कार टी सेल मंच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
इस दोहराव ट्यूमर सेल चैलेंज परख कार टी सेल कार्यात्मक शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है, विट्रो सेटअप में एक का उपयोग कर कि उच्च ट्यूमर vivo में साथ जुड़े बोझ recapitulates ट्यूमर मॉडल । इस 7 दिन की परख के दौरान, कार टी कोशिकाओं ट्यूमर चैलेंज के चार दौर से गुजरना (प्रारंभिक सह संस्कृति और 3x rechallenge), एक वातावरण बनाने जहां थक टी कोशिकाओं को अपनी क्षमता के लिए एक शक्तिशाली प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बावजूद ट्यूमर चुनौती का जवाब खो सकते हैं । ट्यूमर सेल उन्मूलन और कार टी सेल विस्तार दो मौलिक readouts कि इस परख से प्राप्त किया जा सकता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि कार टी कोशिकाओं के phenotypes आसानी से धुंधला सतह या इंट्रासेलर मार्कर कि टी सेल सक्रियण संकेत द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, थकावट और/ इस परख भी गैर-कार टी कोशिकाओं transcriptome, proteome या भास्वर-proteome21,26, और टी सेल polyfunctionality जो नैदानिक प्रतिक्रियाओं27भविष्यवाणी अपनाया गया है के पक्षपातपूर्ण विश्लेषण के साथ गठबंधन करने के लिए सुविधाजनक है । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं को भी इस तरह के साइटोकाइन स्राव28के रूप में टी सेल प्रतिरक्षा के खिलाफ अपने अनुकूली प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया जा सकता है । के बाद से नमूने कई समय बिंदुओं पर काटा जाता है, इस परख न केवल स्थिर के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी कार टी सेल व्यवहार के गतिशील विश्लेषण जब ट्यूमर कोशिकाओं की अधिक संख्या का जवाब ।
परख विशेष रूप से एक ही antigen लक्ष्यीकरण लेकिन विभिंन डिजाइनों और/या विनिर्माण प्रक्रियाओं के साथ कार टी कोशिकाओं की effector शक्ति की तुलना में शक्तिशाली है । हम इस परख का इस्तेमाल किया है की पहचान है कि सीडी 4+ कार टी कोशिकाओं सीडी 8+ कोशिकाओं21से बेहतर दीर्घकालिक effector समारोह मध्यस्थता करने में सक्षम थे । यह भी दिखाया गया है कि वीवो कार प्रभावकारिता में cytotoxicity के साथ सहसंबद्ध था बाद में समय अंक (D5-D7) इस परख के दौरान, आगे के लिए दोहराव ट्यूमर चुनौती का उपयोग करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला विट्रो कार टी सेल मूल्यांकन में । हालांकि gbm कोशिकाओं को लक्षित कोशिकाओं के उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया यहां, इस परख आसानी से एक अलग टी सेल ट्यूमर संयोजन को अपनाया जा सकता है । विशेष रूप से, कार टी सेल व्यवहार भी अलग antigen घनत्व और इंजीनियरिंग कैंसर की कोशिकाओं पर भिंन हो सकते है लक्षित एंटीजन के विभिंन स्तरों को व्यक्त करने के लिए कार की पहचान29पर अनुक्रमिक आणविक घटनाओं की जांच उपकरण प्रदान की । इसलिए, इस परख भी विभिंन लक्ष्यों के खिलाफ कुछ कार टी कोशिकाओं के सक्रियकरण पैटर्न की जांच का दोहन किया जा सकता है ।
लक्ष्य सेल व्यवहार्यता और कार टी सेल विस्तार के बाद से इस परख के दो अग्रिम readouts हैं, यह महत्वपूर्ण है कि सभी सह संस्कृतियों व्यवहार्य के साथ शुरू (> 70%) ट्यूमर और टी कोशिकाओं । जब rechallenge प्रक्रियाओं प्रदर्शन, मीडिया की aspirating की कार्रवाई (चरण ५.३) के लिए कुओं के नीचे में ट्यूमर और टी कोशिकाओं को परेशान नहीं करना चाहिए, क्रम में कोशिकाओं की संख्या में अनावश्यक बदलाव का परिचय नहीं है । जब निलंबन लक्ष्य सेल लाइनों पर इस परख प्रदर्शन, यह ट्यूमर सेल rechallenge से पहले centrifugation द्वारा शेष कोशिकाओं फसल की सिफारिश की है ।
इस परख की एक सीमा है कि सेटअप मानकों (प्रारंभिक सह संस्कृति और rechallenge के e:t अनुपात) अलग कार के आधार पर समायोजित किया जा करने के लिए-ट्यूमर संयोजन की जरूरत है । उदाहरण के लिए, यदि ट्यूमर कोशिकाओं immuno-निरोधात्मक अणुओं (उदा पीडी-l1) के एक काफी स्तर को व्यक्त, एक उच्च e:t अनुपात दिया है कि समग्र हत्या दक्षता पीडी-L1-कम ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में बिगड़ा हुआ है की सिफारिश की है. नई कार के लिए परख लगाने से पहले-ट्यूमर युग्म, एक प्रायोगिक अध्ययन के लिए इष्टतम स्थितियों है, जो आम तौर पर सबसे शक्तिशाली कार टी कोशिकाओं को परख में परीक्षण के अंत बिंदु पर ट्यूमर कोशिकाओं के > 80% को खत्म करने की अनुमति देता है निर्धारित करने की सिफारिश की है । चूंकि प्रत्यक्ष सेल सेल संपर्क कार टी सेल के लिए आवश्यक है मध्यस्थता की हत्या, यदि ट्यूमर कोशिकाओं प्रतिदीप्ति थे-लेबल, तो प्रवाह cytometric विश्लेषण के पैनल तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए अगर ट्यूमर कोशिकाओं gfp थे लेबल, तो किसी भी fitc-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए) ।
बी कोशिका दुर्मताओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की नैदानिक गतिविधि दो एफडीए को मंजूरी दे दी दवाओं के लिए नेतृत्व किया गया है. हालांकि, प्रतिक्रिया में विभिन्न रोगियों में पर्याप्त भिन्नता दिखाई गई है27,30,31, जो कार उत्पादों के लक्षणप्ररूपी गुणों के साथ सहसंबंधित करने के लिए आविर्भाव किया गया था30. इस में विट्रो दोहराव ट्यूमर चैलेंज परख आगे कार्यात्मक लक्षणप्ररूपी विशिष्टताएँ और polyfunctionality साइटोकाइन उत्पादन के अलावा कार effector शक्ति परीक्षण करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है, और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है भविष्यसूचक निष्ठा को बनाए रखते हुए विवो ट्यूमर मॉडल की तुलना में नैदानिक उत्पादों । कुल मिलाकर, इस परख कार टी सेल डिजाइन, पूर्व नैदानिक और नैदानिक विकास के लिए टी सेल कार्यात्मक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए अनुदान द्वारा समर्थित था कैलिफोर्निया संस्थान पुनर्योजी चिकित्सा के लिए (cirm) अनुदान TR3-05641 और nih अनुदान P30 CA33572 (कोर). d.w. nci फैलोशिप 1f99ca234923-01 द्वारा समर्थित है ।
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
1M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
B-27 Serum-Free Supplement (50X) | Invitrogen | 17504-044 | |
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
Heparin Sodium(1,000 U/ml) | American Pharmaceutical | 401811B | |
MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
PBS 1X W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |