Här, beskriver vi en metod för in vitro-samtidig kultur att rekursivt utmaning tumör-riktade T-celler, som möjliggör fenotypiska och funktionell analys av antitumöreffekt T-cellsaktivitet.
Fältet av chimära antigen receptorn (bil) T-cellterapi går snabbt framåt med förbättringar i bildesign, gen-engineering metoder och tillverkning optimeringar. En utmaning för dessa utvecklingsinsatser, har dock varit upprättandet av in vitro-analyser som kraftfullt kan informera val av de optimala bilen T cell produkterna för Invivo terapeutisk framgång. Standard in vitro-tumör-Lys analyser ofta inte återspeglar den verkliga antitumöreffekt potentialen i bil T-cellerna på grund av relativt kort samtidig Kulturtid och höga T-cell tumör-förhållande. Här beskriver vi en in vitro-samtidig kultur metod för att utvärdera bil T cell rekursiv dödande potential vid hög tumör cell laster. I denna analys, långsiktiga cytotoxiska funktion och proliferativ kapacitet av CAR T-celler undersöks i vitro över 7 dagar med ytterligare tumör mål administreras till samtidig kulturen varannan dag. Denna analys kan kopplas till profilering T cellaktivering, utmattning och minne fenotyper. Med denna analys, vi har framgångsrikt framstående funktionella och fenotypiska skillnader mellan CD4+ och CD8+ CAR T-celler mot Glioblastom (GBM) celler, återspeglar deras differentiell Invivo antitumöraktivitet i ortotop xenograft-modeller. Denna metod ger en lättköpt metod att bedöma bil T cell styrka och att klarlägga de funktionella variationerna över olika produkter för CAR T-celler.
Immunterapi med chimära antigen receptorn (bil)-bearbetade T celler har sett lovande resultat mot B-cell maligniteter1,2,3,4, medan potentialen för att rikta andra tumörer fortsätter att vara under noggrann undersökning5,6,7. Stora framsteg har gjorts för att optimera bilen konstruktion, tillverkningsprocessen och patienten före infusion regimer6,7,8, och romanen syntetisk biologi metoder väntas öka sin uthållighet, säkerhet och tumör specificitet9,10. Det har dock varit svårt och arbetsintensiva att korrekt bedöma den terapeutiska potentialen hos CAR T-celler för att vägleda det bästa valet för kliniska översättning. Den mest etablerade modellen hittills för att utvärdera bil T cell-funktion är i nedsatt immunförsvar möss med mänskliga tumör xenograft, whereby CAR T-celler undersöks för antitumöreffekt effekt och jämfört titrerad cell doser11,12 , 13 , 14 , 15. dessa murina studier är arbetskrävande och tidsödande, speciellt när screening stort antal parametrar. Ytterligare, Invivo studier kan vara fastspända med tillgängligheten till mus stammar, Djurvård faciliteter och djur-hanteringstekniker. Därför finns det ett behov att utveckla bekvämare in vitro-analyser som möjliggör snabb avläsning av effektor aktivitet, vilket också troget återspeglar Invivo antitumöreffekt funktionen av dessa T-celler.
Konventionella metoder för att bestämma cytotoxiciteten hos T-celler in vitro-har fokuserat på upptäckt av degranulering, cytokin produktion och förmåga att lysera radioisotop-märkt målcellerna (dvs krom utgåva analyser). Medan dessa analyser är informativ för att definiera bil T cell specificitet och omdirigerade prismalås, misslyckas de ofta med att återspegla Invivo antitumöreffekt potentialen av bakåtkompilerade T celler12,13,16. I vissa fall i vitro visade döda aktivitet i kortsiktiga analyser en omvänd korrelation med Invivo antitumöreffekt funktion16. Sådan inkonsekvens är sannolikt resultatet av hög effektor: mål (E:T) nyckeltal används i dessa in vitro-testmetoder, och därför oförmåga för att skilja bil T cell produkter som är benägna att utmattning17. Däremot under Invivo tumör utrotning T svarar celler vanligtvis mot stor tumör bördor, vilket kräver flera rundor av döda och därefter köra T cell differentiering och utmattning18,det19, 20, som är en av de största hindren mot effektiva tumör clearance av bil T celler12,13. Under tiden, mest kortsiktiga in vitro-dödande analyser också göra inte avläsningen skillnader i T cellproliferation, medan bil T cell behandlade patienter kapacitet för bil T cell expansion är starkt korrelerad med kliniska svar4. Således, den lämpliga in vitro-test skulle behöva sammanfatta villkoren för hög tumör börda, induktion av T-cell utmattning, och möjliggör utläsningen av T-cell expansion.
Här beskriver vi en strategi för att utvärdera CAR T-celler för repetitiva tumör dödande potential med en enkel in vitro-samtidig kultur-analysen. Olika T-cell effector aktivitetsparametrarna kan undersökas samtidigt, inklusive målet cellen dödande, bil T cell expansion och minne – eller utmattning-associerade fenotyper. De resultat som genereras från denna analys korrelerar väl med Invivo antitumöreffekt effekten av CAR T-celler och kan utnyttjas för att bedöma styrkan av bil T cell produkter. Medan vi beskriva ett test för att utvärdera IL13Ra2-riktade CAR T-celler mot primära GBM linjerna21, kan den lätt anpassas till någon bil T cell plattform.
Denna repetitiva tumör cell utmaning analys ger en bekväm metod för att utvärdera bil T cell funktionell styrka, med en in vitro-setup som recapitulates hög tumör bördan är associerad med Invivo tumör modeller. Under denna 7-dagars test, CAR T-celler genomgår fyra rundor av tumör utmaning (inledande samarbete kultur och 3 x återinsättning), att skapa en miljö där utmattad T-celler kan förlora sin kapacitet att bemöta tumör utmaning trots en potent första svar. Tumör cell eliminering och bil T cell expansion representerar två grundläggande avläsning som kan förvärvas från denna analys, medan fenotyperna av CAR T-celler kan enkelt analyseras genom färgning ytan eller intracellulära markörer som indikerar T-cellsaktivering, utmattning och/eller minne. Denna analys är också praktiskt att kombinera med icke-partisk analys av bil T celler transkriptom proteomet eller fosfor-proteomet21,26och T-cell polyfunctionality som har antagits för att förutsäga kliniska svar27. Tumörceller kan dessutom också testas för deras adaptiv respons mot T-cell immunitet såsom cytokin sekretion28. Eftersom proverna skördas vid flera tidpunkter, möjliggör denna analys inte bara statisk, men också dynamisk analys av bil T cell beteende när du svarar på överskjutande antalet tumörceller.
Analysen är särskilt kraftfull i jämföra effektor styrkan av CAR T-celler som inriktning samma antigen men med olika mönster eller tillverkningsprocesser. Vi har använt denna analys för att identifiera att CD4+ bil T celler skulle kunna medla överlägsen långsiktig effektor funktion än CD8+ celler21. Det visades också att i vivo BILHYRA effekten var korrelerad med Cytotoxiciteten vid senare tidpunkter (D5-D7) under denna analys, ytterligare belyser nödvändigheten av att använda repetitiva tumör utmaning för in vitro-bil T cell utvärdering. Även om GBM celler användes som exempel av målceller här, kunde denna analys antas enkelt till en annan T-cell-tumör kombination. Särskilt, kan bil T cell beteende också variera vid olika antigen tätheter och engineering cancerceller att uttrycka olika nivåer av riktade antigener som verktyget för att undersöka sekventiell molekylära händelser vid bil erkännande29. Denna analys kan därför också utnyttjas för att granska mönstret för aktivering av vissa CAR T-celler mot olika mål.
Sedan målet cellernas viabilitet och bil T cell expansion är två upfront avläsning av denna analys, är det viktigt att alla samtidig kulturer börja med livskraftiga (> 70%) tumör och T-celler. När du utför återinsättning processerna, bör åtgärden av utvärderingsenheten media (steg 5.3) inte störa tumör och T-celler i botten av brunnarna, för att inte införa onödiga variationer av celler räknas. När du utför denna analys på suspension mål cellinjer, rekommenderas det att skörda resterande celler genom centrifugering före tumör cell återinsättning.
En begränsning av denna analys är att inställningsparametrar (E:T förhållandet mellan inledande samarbete kultur och återinsättning) måste anpassas utifrån olika bil-tumör kombinationer. Till exempel, om tumörcellerna uttrycker en betydande nivå av immuno-hämmande molekyler (t.ex. PD-L1), högre E:T förhållande rekommenderas med tanke på att övergripande döda effektivitet är nedsatt jämfört med PD-L1-low tumörceller. Innan analysen till nya bil-tumör kombinationer, en pilotstudie rekommenderas att fastställa optimala förutsättningar, som tillåter vanligtvis de mest potenta CAR T-celler som testas i analysen att eliminera > 80% av tumörcellerna vid slutpunkten. Eftersom direkta cell-cell kontakt behövs för bil T cell-medierad dödande, om tumörcellerna var fluorescens-märkt, sedan panelen i flödet flödescytometrisk analys måste justeras (t.ex. om tumörcellerna var GFP-märkta, sedan alla FITC-konjugerad antikroppar bör inte användas).
Den kliniska aktiviteten av CAR T-celler mot B-cell maligniteter har lett till två FDA-godkända läkemedel. Svaret har emellertid visat stor variation mellan olika patienter27,30,31, som var klarlagd korrelera med de bil produkter30fenotypiska egenskaper. Denna in vitro-repetitiva tumör utmaning analys ytterligare innehåller en metod för att testa funktionellt bil effektor styrkan utöver de fenotypiska karakteriseringar och polyfunctionality cytokin produktion och möjliggör högre genomströmning screening av kliniska produkter i jämförelse med Invivo tumör modeller bibehållen prediktiva trohet. Sammantaget skulle denna analys kunna användas för T-cell funktionstest för bil T cell design, preklinisk och klinisk utveckling.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) grant TR3-05641 och NIH grants P30 CA33572 (kärnor). D.W. stöds av NCI gemenskap 1F99CA234923-01.
0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Corning | MT25051CI | |
1M Hepes | Irvine Scientific | 9319 | |
200 mM L-Glutamine | Cambrex Bio Science | 17-605E | |
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) – FluoroPure grade | Invitrogen | D21490 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Aldesleukin Proleukin (rhIL-2) | Novartis Oncology | NDC 0078-0495-61 | |
Anti-CD137, PE | BD Biosciences | 555956 | 4B4-1 |
Anti-CD19, PE-Cy7 | BD Biosciences | 557835 | SJ25C1 |
Anti-CD3, PERCP | BD Biosciences | 340663 | SK7 |
Anti-CD4, FITC | BD Biosciences | 340133 | SK3 |
Anti-CD45, PERCP | BD Biosciences | 340665 | 2D1 |
Anti-CD45RO, PE | BD Biosciences | 561137 | UCHL1 |
Anti-CD62L, APC | BD Biosciences | 559772 | DREG-56 |
Anti-CD69, APC | BD Biosciences | 340560 | L78 |
Anti-CD8, APC-Cy7 | BD Biosciences | 348793 | SK1 |
Anti-IL-13, PE | BD Biosciences | 340508 | JES10-5A2 |
Anti-LAG-3, PE | eBiosciences | 12-2239-41 | 3DS223H |
Anti-PD-1, APC-Cy7 | BioLegend | 329921 | EH12.2H7 |
Anti-TIM-3, APC | eBiosciences | 17-3109-42 | F38-2E2 |
B-27 Serum-Free Supplement (50X) | Invitrogen | 17504-044 | |
Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596) | Corning Life Sciences | 3596 | |
Defined fetal bovine serum,HI IR | Hyclone Labs | SH30070.03IH | |
DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine | MediaTech, Inc. | 15-090-CV | |
DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L | Invitrogen | 11960051 | |
DMEM-Ham's F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES | Fisher Scientific | MT10092CV | |
HBSS | Irvine Scientific | 9224 | |
Heat-Inactivated FCS | Hyclone | SH30070.03 | |
Heparin Sodium(1,000 U/ml) | American Pharmaceutical | 401811B | |
MACSQuant | Milteni Biotech Inc. | BIS013220 | |
PBS 1X W/CA & MG | Irvine Scientific | 9236 | |
PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+) | VWR Scientific Products | PB15009A | |
Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Recombinant human FGF | R&D Systems | 233-FB | |
rhIL-15 Working Dilution (10 ng/µL) | CellGenix, US Operations | tF0297 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S8032 | |
Sorvall ST40R | Thermo Scientific | 41693700 | |
TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML | IRVINE SCIENTIFIC CORP | 6472 | |
Tecnol Procedure Mask | Kimberly-Clark | 47117 | |
X-VIVO 15 | Lonza | BW04-744Q |