נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.
הפונקציה מיטוכונדריאלי האופטימלי הוא קריטי עבור פעילות תאית בריאה, במיוחד בתאי בעלי אנרגיה גבוהה דרישות כמו אלה במערכת העצבים, שרירים. בקנה אחד עם זה, תפקוד מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר עצום של מחלות ניווניות והתיישנות באופן כללי. Caenorhabditis elegans כבר מערכת מודל רב עוצמה עבור שחקרתי המורכבות הרבה של הפונקציה מיטוכונדריאלי. נשימה מיטוכונדריאלי הוא סימן חזק של פונקציה מיטוכונדריאלי, respirometers פיתחה לאחרונה מציעים פלטפורמה המדינה-of-the-art כדי למדוד את הנשימה בתאים. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה לנתח חיים, שלמים C. elegans. פרוטוקול זה משתרע על פני תקופה של ~ 7 ימים, כולל שלבי (1) גדל וסינכרון של C. elegans, (2) הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים, equilibration וטעינה של מחסנית סמים (3), (4) הכנת assay תולעת צלחת assay לרוץ ו ניתוח נתונים לאחר הניסוי (5).
אדנוזין טריפוספט (ATP), המקור העיקרי של אנרגיה תאית, מיוצר בתוך המיטוכונדריה על ידי אנזימים בשרשרת האלקטרונים תחבורה (וכו ‘) הממוקם בתוך הקרומית מיטוכונדריאלי הפנימי. פירובט, מטבוליט מפתח מנוצל לייצור ATP מיטוכונדריאלי, מיובא לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי איפה decarboxylated לייצר אצטיל קואנזים A (CoA). לאחר מכן, אצטיל CoA מזין את מעגל קרבס וכתוצאה מכך הדור של nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), מולקולה נשא אלקטרונים מפתח. כמו אלקטרונים NADH מועברים למנהל חמצן דרך ועוד, פרוטונים לבנות בחלל intermembrane מיטוכונדריאלי, דבר המתבטא הדור הצבע אלקטרוכימי על פני הקרום. אלה פרוטונים יזרום אז מן המרחב intermembrane מעבר הדרגתי אלקטרוכימי הזה בחזרה לתוך המטריקס מיטוכונדריאלי דרך הנקבובית פרוטון של ATP סינתאז, נהיגה הסיבוב שלה, הסינתזה של ATP1 (איור 1).
הפונקציה מיטוכונדריאלי אינה מוגבלת ייצור אנרגיה, אבל הוא גם מכריע הומאוסטזיס סידן, מינים חמצן תגובתי (ROS) ניקוי של אפופטוזיס, אנושות מיצוב תפקידם בריאות organismal2. הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להיות מוערך באמצעות מגוון של מבחני, כולל אך לא מוגבל ניתוחים המודדים מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית רמות ATP ו- ROS, ריכוזי סידן מיטוכונדריאלי. עם זאת, אלה מבחני לספק תמונה אחת של פונקציה מיטוכונדריאלי, ולכן אולי לא מספקת תצוגה מקיפה של בריאות מיטוכונדריאלי. מאז צריכת חמצן בעת יצירת ATP הוא מסתמך על מספר עצום של תגובות רציפים, היא מגישה כסמן מעולה של פונקציה מיטוכונדריאלי. מעניין, וריאציות שיעורי צריכת חמצן נצפו כתוצאה בתפקוד מיטוכונדריאלי3,4,5.
שיעורי צריכת חמצן (OCR) של החיים דוגמאות ניתן למדוד באמצעות טכניקות ניתן לחלק לשתי קבוצות: amperometric חיישני חמצן, חומר זרחני מבוססי פורפירין זה יכול לכלותה חמצן6. חיישני חמצן Amperometric נעשה שימוש נרחב מודדים OCR ב בתרבית תאים, רקמות, וב -דגם מערכות, כגון C. elegans. עם זאת, חומר זרחני מבוססי פורפירין המכיל respirometers יש את היתרונות הבאים: (1) שהם מאפשרים השוואה לצד השני של שני מדגמים שהפקידים, (2) הם דורשים גודל מדגם קטן יותר (למשל, תולעים 20 לכל טוב לעומת ~ 2, 000−5, 000 תולעים קאמרית)7, ו- (3) ניתן לתכנת את respirometer לעשות ארבע זריקות מורכבים שונים-רצוי פעמים לאורך כל רץ ניסיוני, ומבטל את הצורך עבור יישום ידני.
פרוטוקול זה, הם שלבים המעורבים בשימוש של פורפירין מבוססות חיישן חמצן respirometer מודדים OCR ב- חיים, שלמים C. elegans מתואר. אמנם יש פרוטוקול בכתב לשימוש בפורמט גדול, תפוקה גבוהה respirometer8, פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם מכשיר ידידותי, נגיש וקטן בהיקף תקציב נוסף. פרוטוקול זה שימושי במיוחד להערכת ההבדל ב- OCR בין שני זנים, שבו לא נדרש ההקרנה תפוקה גבוהה, השימוש בו יהיה מוגזם.
נשימה מיטוכונדריאלי הוא מחוון תובנה של פונקציה מיטוכונדריאלי; לכן, היכולת למדוד את שיעור צריכת החמצן במערכת הביולוגית, בין אם במבחנה או ויוו הוא חשוב מאוד. Respirometers חש רמות החמצן באמצעות חומר זרחני מבוססי פורפירין זה לקבל מתרצה באמצעות חמצן או באמצעות חיישני חמצן amperometric המסתמכים על הדור של…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להכיר את ד ר קווין Bittman להדרכה שלו בהקמת את XFp סוסון ים במעבדה. מכוני הבריאות הלאומיים הענק ש-gm088213 נתמך עבודה זו.
100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
Bleach | Generic | ||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
Deionized water (dH2O) | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |