Her præsenterer vi en protokol til at udtrække, løse og identificere mitokondrie-super komplekser, som minimerer eksponeringen for rengøringsmidler og Coomassiel Blue. Denne protokol giver en optimal balance mellem opløsning og bevaring af enzym aktiviteter, samtidig med at risikoen for at miste labile protein-protein interaktioner minimeres.
Komplekser af den oxidativ fosforyleringemaskiner danner supramokylære protein arrangementer ved navn super komplekser (SCS), som menes at give strukturelle og funktionelle fordele til mitokondrier. SCs er blevet identificeret i mange arter, fra gær til pattedyr, og et stigende antal undersøgelser rapporterer afbrydelse af deres organisation i genetiske og erhvervede sygdomme hos mennesker. Som følge heraf er et stigende antal laboratorier interesseret i at analysere SCs, hvilket kan være metodisk udfordrende. Denne artikel præsenterer en optimeret protokol, der kombinerer fordelene ved Blue-og Clear-Native PAGE-metoder til at løse og analysere SCs på en tidseffektiv måde. Med denne hybride KN/BN-PAGE-metode eksponeres mitokondrie SCs med optimale mængder af det milde rengøringsmiddel digitonin kort for det anioniske farvestof Coomassies Blue (CB) i begyndelsen af elektroforese, uden udsættelse for andre rengøringsmidler. Denne korte udsættelse for CB gør det muligt at adskille og løse SCs så effektivt som med traditionelle BN-PAGE metoder, og samtidig undgå den negative virkning af høje CB niveauer på in-gel aktivitet assays, og labile protein-protein interaktioner inden for SCs. Med denne protokol er det således muligt at kombinere præcise og hurtige målinger af gel-aktivitet med analytiske teknikker, der involverer 2D elektroforese, immuno-detektion og/eller proteomics til avanceret analyse af SCs.
Mitochondrier producerer energi gennem oxidativ fosforylering, hvor respiratoriske komplekser I-II-III-IV oxideres substrater og overfører elektroner til ilt, hvilket genererer en gradient, der tillader fosforylering af ADP ved ATP-syntase (CV). I de seneste år har omfattende undersøgelser vist, at respiratoriske kæde komplekser ikke udelukkende er indarbejdet lineært i den indre mitokondriel membran, men også er organiseret i superkomplekser (SCS) arrangement1,2. I pattedyrs mitokondrier findes SCs i varierende stokiometri: CI/CIII2/CIV1-4 (som kaldes respirasome, og som er i stand til at NADH: O2 oxidoreduction in vitro)2, CI/CIII2og CIII2 /CIV1-23,4. Desuden fordeles respiratoriske komplekser under forskellige forhold mellem deres frie form og SCs-arrangementer. Det anslås derfor, at 85% – 100% af CI, 55% – 65% af CIII og 15% – 25% af CIV findes i SCs4. Disse supramoolekylære strukturer menes at mindske ROS produktion, stabilisere eller hjælpe i samlingen af individuelle komplekser, regulere respiratoriske kæde aktivitet, og forhindre protein aggregering i proteinrige indre mitokondriel membran5 ,6,7,8. Deres remodellerings evne efter variation i energiefterspørgslen og deres betydning i patogenesen af sygdomme er ved at blive undersøgt i flere laboratorier3,7,9,10, 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14. undersøgelser har vist, at patologiske ændringer i SCS-samlingen er til stede i en række forskellige lidelser, herunder, men ikke begrænset til, genetiske defekter i kardiolipin-syntese15, hjerteinsufficiens16, iskæmi-reperfusion17, diabetes12, og aldring18.
Native elektroforese og immunodetektion er almindeligt anvendt i SCS undersøgelser til at løse oxphos komplekser kvaternære arrangementer2,19,20,21. Native elektroforese kan yderligere kombineres med specifikke i gel aktivitet analyser eller 2D-SDS side for at muliggøre præcis Molekylær bestemmelse af de forskellige SCS samlinger1,19. Evnen til at studere SCs afhænger i afgørende grad af udvindings forholdene, herunder type og koncentration af anvendt vaskemiddel, ionisk styrke og pH, samt på elektroforetiske migrations forhold, som omfatter buffer sammensætning, tilstedeværelse af CB, gel størrelse og acrylamid procent2.
Protokoller og SCs band opløsning varierer meget mellem papirer, hvilket gør sammenligning mellem undersøgelser vanskelig og tilpasning af metoder udfordrende22. Derfor foreslås der i dette dokument en robust og optimal protokol til at udtrække SCs fra isolerede mitokondrier af forskellige kilder med det ikke-ioniske rengøringsmiddel digitonin og til at løse højmolekylære SCs-bånd. Den optimerede vaskemiddel koncentration, sammensætning af ekstraktions bufferen og fraværet af Coomassie Blue i prøveforberedelsen minimerer afbrydelse af protein komplekser. Denne protokol (Se figur 1 for en oversigt) kombinerer cn-Page og bn-Page for optimale SCS-samlinger opløsning på stor gel, og er kompatibel med in-gel aktivitet analyser giver bedre visualisering af reaktive bands, sammen med brugen af immun detektering for en detaljeret analyse SCs arrangementer og sammensætning.
Mitokondrielle super komplekser er aktivt undersøgt for at belyse deres fysiologiske rolle, og deres betydning i patogenesen af talrige sygdomme hos mennesker, uanset om de erhverves eller genetiske mitokondrielle sygdomme3,7 , 9 ud af , 10 stk. , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14. for at opnå pålidelige resultater er det nødvendigt at overveje flere aspekter. Denne protokol er blevet testet med muselever mitokondrier, mus skeletmuskulatur mitokondrier (resultater ikke vist), rotte hjerte mitokondrier, og humane fibroblast mitokondrier (resultater ikke vist), men kunne helt sikkert tilpasses til andre kilder til isolerede Mitokondrier. Metoden kombinerer forskellige aspekter af bn og cn-side protokoller, som gør det muligt at reducere eksponeringen for detergenter og anioniske forbindelser til et minimum i forhold til offentliggjorte protokoller20,27,28.
Forberedelse af prøver
Prøveforberedelse er et afgørende skridt for en vellykket adskillelse af SCs. buffer sammensætning bør nøje udvælges for at opnå en korrekt opløselig opløsning af proteiner og proteiner, samtidig med at det bevarer så meget som muligt deres funktionelle og strukturel integritet. Ionisk styrke og pH af ekstraktions bufferen er to vigtige faktorer at overveje. Saltkoncentrationer, der er for lave (< 50 mM K-acetat eller NaCl), vil resultere i dårlig opløsning af proteiner i tilstedeværelse af nonioniske rengøringsmidler, mens saltkoncentrationer over 500 mM vil fremme protein stabling/-aggregering og udfældning af CB og proteiner29. SCs bør derfor ekstraheres ved hjælp af buffere nær fysiologisk ionstyrke. Med hensyn til pH anbefales det at anvende en nær fysiologisk pH-værdi.
Vaskemiddel type og forholdet mellem rengørings-og protein er også afgørende for optimal SC ekstraktion. For maksimal bevaring af indbyggede SCs foretrækkes digitonin26. Som det fremgår af denne protokol og andre offentliggjorte metoder23,30,31,32, bevarer dette milde rengøringsmiddel den supramoolekylære sammensætning af flere SC-samlinger, og den dimeriske og oligomerisk struktur af ATPsynthase (figur 3 og figur 4). Titrering af prøver af interesse med forskellige mængder af digitonin er afgørende for at identificere de forhold, der muliggør optimal solubilisering, samtidig med at enzymaktivitet og fysiologiske protein interaktioner bevares. Titrering skal udføres med forhold mellem 2 og 8 g/g26. Optimale resultater for leveren, skeletmuskulaturen og hjerte mitokondrier opnås med henholdsvis 4, 5 og 6 g digitonin/g protein. Det skal bemærkes, at digitonin kan erstattes af Triton X-100, som under optimale forhold resulterer i tilsvarende migration og SC-komposition som dem, der observeres med digitonin2. Dette rengøringsmiddel bør dog anvendes med forsigtighed, da relativ lille stigning i forholdet mellem rengøringsmiddel og protein (f. eks. fra 1 til 1,5 g/g) kan resultere i en fuldstændig afkobling af SCs-samlinger2, hvilket kan resultere i eksperimentelle uoverensstemmelser. Efter ekstraktion suppleres prøverne traditionelt med coomassie Blue for at give proteiner en ladning, når de påføres gelen, med undtagelse af den traditionelle KN-side20,26. For at minimere protein eksponeringen for coomassie blå og potentiel afkobling af labile proteiner suppleres prøverne ikke med coomassie Blue i denne protokol.
Elektroforese
Både CN-PAGE og BN-PAGE er blevet brugt til at studere mitokondrial OXPHOS-komplekser, der hver især har særskilte fordele og begrænsninger. De mildere betingelser, der anvendes under CN-PAGE (hovedsagelig fraværet af CB, som har en vaske-lignende effekt), muliggør en bedre konservering af ATP-syntase i-gel-aktivitet og begrænser dissociationen af labile proteiner i højmolekylære SCs og ATP-syntase Samlinger26. Fraværet af det anioniske farvestof CB i proteinet ekstrakt og elektroforese buffere får proteinerne til at migrere baseret på deres iboende ladning og isoelektrisk punkt, hvilket reducerer den elektroforetiske mobilitet af proteiner i gelen26. Desuden, i mangel af CB, proteiner med utilstrækkelig negativ ladning tendens til at aggregere, og dermed reducere opløsningen af protein komplekser i gel20,26. For at omgå disse begrænsninger er den såkaldte KN-side med høj opløsning blevet udviklet af Wittig og Schragger20. I denne protokol tilsættes natriumdeoxycholat (DOC) og forskellige milde, ikke-ioniske rengøringsmidler (DDM, Triton X100) til katinbufferen for at holde membran proteinerne opløsnet og pålægge et negativt gebyr skift på proteiner, hvilket resulterer i en betydelig forbedring af resolution20.
Et karakteristisk træk ved den nuværende hybride KN/BN-protokol er, at der kan opnås en sammenlignelig opløsning uden disse vaske-og rengøringsmidler. Momentan tilsætning af CB til kattebufferen i begyndelsen af elektroforese er tilstrækkelig til at begrænse protein sammenlægningen og øge mobiliteten i gelen (figur 3 og figur 4). Som et resultat, denne hybrid teknik muliggør fremragende opløsning af særskilte SC samlinger og meget lav eller ingen eksponering for vaske-og rengøringsmidler. Tilstedeværelsen af lave mængder af CB giver også bedre beskyttelse af CV aktivitet, forbedret bevaring af dimeriske og oligomere CV forsamlinger (figur 3 og Wittig og schägger 200526), og en reduktion af den blå baggrundsstøj, der kan hæmme kvantificeringen af gel-aktiviteter, især for CII og CIV (figur 2). Desuden begrænser fraværet af CB i protein ekstrakten afbrydelsen af labile protein interaktioner inden for SCs. For eksempel, fysisk Association af ATP syntase med ANT til at danne synthasome 33 eller med cyclophilin-D til at regulere PTP åbning 34 ses bedre i fravær af CB. Midlertidig udsættelse for CB under elektroforese kan derfor være nyttig til at afsløre nye protein interaktioner inden for SCs. denne hybride KN/BN-PAGE-protokol giver således mulighed for at kombinere præcise og hurtige målinger af gel-aktivitet med analytiske teknikker, der involverer 2D elektroforese, immuno-detektion og/eller proteomics til avanceret analyse af SCs. Det skal bemærkes, at med den stigende interesse for SCS, et stigende antal undersøgelser bruger små 10 x 10 cm geler for native Page. Selv om denne fremgangsmåde kan være tilstrækkelig til at identificere grove ændringer i de overvældende SC-samlinger, er den lavere separations kapacitet for små geler sandsynligvis begrænset til at løse subtile rekonstruktioner eller til at skære særskilte bånd til proteomiske analyse. Desuden har flere undersøgelser, der anvender mindre geler, rapporteret, at respirasomet migrerer i samme størrelse som ATPsynthase dimer, hvilket gør det vanskeligt at adskille dem22. Derfor bør brugen af store geler foretrækkes.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Jenna Rossi for teknisk assistance, og Dr. Mireille Khacho, Dr. David Patten og Dr. Ujval Anil Kumar for nyttige diskussioner, mens udvikling af denne metode. Dette arbejde blev finansieret af de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR) og national Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC). AC er modtager af doktor Award-Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarships (CIHR).
3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
Acrylamide | Sigma | A3553 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
Imidazole | Sigma | I0250 | |
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |