यहाँ हम एक प्रोटोकॉल को निकालने, संकल्प और माइटोकॉन्ड्रियल supercomplexes जो डिटर्जेंट और coomassie नीला करने के लिए जोखिम कम पहचान करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल संकल्प के बीच एक इष्टतम संतुलन, और एंजाइम गतिविधियों के संरक्षण प्रदान करता है, जबकि अस्थिर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत खोने के जोखिम को कम करने ।
ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरीलेशन मशीनरी के परिसरों सुपरकॉम्प्लेक्स (एससीएस) नाम से अधिमोलाकुलर प्रोटीन व्यवस्था बनाते हैं, जो माइटोकॉन्ड्रिया को संरचनात्मक और कार्यात्मक लाभ प्रदान करने के लिए माना जाता है । कई प्रजातियों में अनुसूचित जातियों की पहचान की गई है, खमीर से स्तनपायी, और अध्ययन की एक बढ़ती हुई संख्या रिपोर्ट में उनके संगठन के आनुवंशिक और अधिग्रहीत मानव रोगों में व्यवधान । नतीजतन, प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या अनुसूचित जातियों का विश्लेषण करने में रुचि रखती है, जो कि methodologically चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यह आलेख एक ऑप्टिमाइज़ किया गया प्रोटोकॉल जो नीले और स्पष्ट-मूल पृष्ठ विधियों के लाभों को हल करने और एक समय प्रभावी तरीके से SCs का विश्लेषण करने के लिए जोड़ती है प्रस्तुत करता है । इस हाइब्रिड CN/बीएन-पृष्ठ विधि के साथ, माइटोकॉन्ड्रियल अनुसूचित जाति हल्के डिटर्जेंट डिजिटोनिन की इष्टतम मात्रा के साथ निकाला संक्षेप ऋणायनी डाई coomassie नीले (सीबी) के लिए संक्षिप्त उजागर कर रहे हैं electrophoresis की शुरुआत में, अन्य डिटर्जेंट के लिए जोखिम के बिना. सीबी के लिए यह कम जोखिम अलग और अनुसूचित जातियों के रूप में प्रभावी रूप से पारंपरिक बीएन पृष्ठ के तरीकों के साथ के रूप में हल करने के लिए अनुमति देता है, जबकि में जेल गतिविधि assays हैं, और अस्थिर प्रोटीन प्रोटीन-अनुसूचित जातियों के भीतर बातचीत पर उच्च सीबी स्तर के नकारात्मक प्रभाव से परहेज । इस प्रोटोकॉल के साथ यह संभव है कि जेल गतिविधि मापन में सटीक और तेजी से गठबंधन करने के लिए 2 डी electrophoresis, immuno पता लगाने, और/
माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरीलेशन के माध्यम से ऊर्जा का उत्पादन करता है, जहां श्वसन परिसरों i-ii-iii-IV ऑक्सीकरण substrates और ऑक्सीजन के लिए स्थानांतरित इलेक्ट्रॉनों, एक ढाल है कि एटीपी सिंथेस (CV) द्वारा adp के फ़ॉस्फोरीलेशन की अनुमति देता है पैदा । पिछले वर्षों में, व्यापक अध्ययनों से पता चला है कि श्वसन श्रृंखला परिसरों को केवल भीतरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में रेखीय तरीके से शामिल नहीं किया जाता है, बल्कि इसे सुपरकॉम्प्लेक्स (एससीएस) व्यवस्था1,2में भी व्यवस्थित कर दिया जाता है । स्तनधारी mitochondria में, एससी अलग stoichiometries में मौजूद हैं: CI/CIII2/ciii1-4 (जो respirasome नाम है, और जो nadh में सक्षम है: ओ2 oxidoreduction में विट्रो)2, सीआई/ /Civ1-23,4। इसके अलावा, श्वसन परिसरों को उनके मुक्त रूप और अनुसूचित जातियों की व्यवस्थाओं के बीच विभिन्न अनुपात में वितरित किया जाता है । इसलिए, यह अनुमान लगाया गया है कि अनुसूचित जातियों में 85 प्रतिशत-100 प्रतिशत सीआई, 55 प्रतिशत-सीआईटीआई का 65 प्रतिशत और सीआईवी का 15 प्रतिशत-25 प्रतिशतएससी में पाया जाता है । इन supramolecular संरचनाओं ROS उत्पादन में कमी करने के लिए सोचा रहे हैं, स्थिर या व्यक्तिगत परिसरों की विधानसभा में सहायता, श्वसन श्रृंखला गतिविधि को विनियमित, और प्रोटीन अमीर भीतरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकने5 ,6,7,8. ऊर्जा की मांग में भिन्नता और रोगों के रोगजनन में उनके महत्व पर उनके रीमॉडलिंग क्षमता कई प्रयोगशालाओं में जांच की जा रही है3,7,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. अध्ययनों से साबित कर दिया है कि अनुसूचित जाति विधानसभा में रोग परिवर्तन सहित विकारों की एक किस्म में मौजूद हैं, लेकिन तक ही सीमित नहीं है, cardiolipin संश्लेषण15में आनुवंशिक दोष, दिल की विफलता16, ischemia-17reperfusion,12मधुमेह, और उंर बढ़ने18।
स्थानीय इलेक्ट्रोफोरेसिस और इम्यूनोडिटेक्शन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है SCs में oxphos परिसरों चतुर्थ व्यवस्था2,19,20,21को हल करने के लिए अध्ययन । देशी वैद्युतकणसंचलन आगे जेल गतिविधि में विशिष्ट के साथ संयुक्त किया जा सकता है assays है या 2d-sds पृष्ठ विभिंन अनुसूचित जातियों विधानसभाओं1,19के सटीक आणविक निर्धारण को सक्षम करने के लिए । अनुसूचित जातियों के अध्ययन करने की क्षमता गंभीर रूप से निष्कर्षण शर्तों पर निर्भर है, प्रकार और डिटर्जेंट का इस्तेमाल किया, ईओण ताकत और पीएच, साथ ही साथ electrophoretic प्रवास शर्तों, जो बफर संरचना शामिल पर, सीबी की उपस्थिति, जेल आकार, और एक्रिलामाइड प्रतिशत2।
प्रोटोकॉल और सीएस बैंड संकल्प कागज के बीच काफी भिंनता है, अध्ययन मुश्किल और22चुनौतीपूर्ण तरीकों के अनुकूलन के बीच तुलना कर रही है । इसलिए, इस पत्र में गैर-आयनिक डिटर्जेंट डिजिटोइन के साथ विभिन्न स्रोतों के अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रिया से अनुसूचित जातियों को निकालने और उच्च आण्विक वजन वाले एससीएस बैंड को हल करने के लिए एक मजबूत और इष्टतम प्रोटोकॉल का प्रस्ताव है । अनुकूलित डिटर्जेंट एकाग्रता, निष्कर्षण बफर की संरचना, और नमूना तैयार करने में Coomassie नीले रंग की अनुपस्थिति प्रोटीन परिसरों के विघटन को कम । इस प्रोटोकॉल (एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें) को जोड़ती है CN-पृष्ठ और बीएन-पृष्ठ के लिए इष्टतम SCs विधानसभाओं संकल्प बड़े जेल पर, और के साथ संगत है जेल में गतिविधि assays हैं, प्रतिक्रियाशील बैंड के बेहतर दृश्य की अनुमति के उपयोग के साथ एक विस्तृत विश्लेषण के लिए immunodetection SCs व्यवस्था और संरचना.
माइटोकॉन्ड्रियल सुपरकॉम्प्लेक्स सक्रिय रूप से उनकी शारीरिक भूमिका को स्पष्ट करने के लिए अध्ययन किया जा रहा है, और कई मानव रोगों के रोगजनन में उनके महत्व, चाहे वे प्राप्त कर रहे हैं या आनुवंशिक माइटोकॉन्ड्रियल रोगों3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. आदेश में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल माउस जिगर माइटोकॉन्ड्रिया, माउस कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया (नहीं दिखाया परिणाम) के साथ परीक्षण किया गया है, चूहा दिल माइटोकॉन्ड्रिया, और मानव फाइकोब्लास्ट माइटोकॉन्ड्रिया (परिणाम नहीं दिखाया गया है), लेकिन निश्चित रूप से अलग के अंय स्रोतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता Mitochondria. विधि बेहतर BN और CN-पृष्ठ प्रोटोकॉल, जो डिटर्जेंट और ऋणायनी यौगिकों के लिए एक ंयूनतम करने के लिए जोखिम को कम करने की अनुमति के विभिंन पहलुओं को जोड़ती है प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में20,27,28।
नमूना तैयारी
नमूना तैयार करना अनुसूचित जातियों के सफल पृथक्करण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । बफर संघटन ध्यान से प्रोटीन और प्रोटीन विधानसभाओं के उचित विलेयीकरण प्राप्त करने के लिए चयन किया जाना चाहिए, जबकि संरक्षण के रूप में ज्यादा के रूप में संभव उनके कार्यात्मक और संरचनात्मक अखंडता । ईओण शक्ति और निष्कर्षण बफर के पीएच दो महत्वपूर्ण कारकों पर विचार कर रहे हैं । नमक की सांद्रता जो बहुत कम (< ५० मिमी-एसीटेट या NaCl) है, में गैर-आयनिक अपमार्जकों की उपस्थिति में प्रोटीन के अल्प विलेनीकरण का परिणाम होगा, जबकि ५०० मिमी से अधिक नमक सांद्रण प्रोटीन stacking/एकत्रीकरण को बढ़ावा देगा, और सीबी और प्रोटीन29। अनुसूचित जातियों इसलिए निकट शारीरिक ईओण ताकत पर बफ़र्स का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए । पीएच के संबंध के साथ, एक निकट शारीरिक पीएच के उपयोग की सिफारिश की है ।
इष्टतम अनुसूचित जाति निष्कर्षण के लिए डिटर्जेंट प्रकार और डिटर्जेंट/प्रोटीन अनुपात भी महत्वपूर्ण है । मूल अनुसूचित जातियों के अधिकतम परिरक्षण के लिए, डिजिटोइन को26वरीयता दी जाती है । के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल और अंय प्रकाशित विधियों23,30,31,३२में दिखाया गया है, इस हल्के डिटर्जेंट एकाधिक अनुसूचित जाति विधानसभाओं के supramolecular संरचना को बरकरार रखता है, और द्विभाजक और एपेसिनथेस की अल्पमारिक संरचना (चित्रा 3 और चित्रा 4). डिजिटोनिन की विभिंन मात्रा के साथ ब्याज के नमूनों की अनुमापन के लिए स्थिति है कि इष्टतम solubilization की अनुमति की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि एंजाइम गतिविधि और शारीरिक प्रोटीन बातचीत के संरक्षण । अनुमापन 2 और 8 जी के बीच लेकर अनुपात के साथ प्रदर्शन किया जानाचाहिए/ जिगर के लिए इष्टतम परिणाम, कंकाल की मांसपेशी और कार्डियक माइटोकॉन्ड्रिया क्रमशः 4, 5, और 6 जी digitonin/जी प्रोटीन के साथ प्राप्त कर रहे हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि डिजिटोनिन triton एक्स से प्रतिस्थापित किया जा सकता है-१००, जो इष्टतम शर्तों के तहत इसी तरह के प्रवास में परिणाम और अनुसूचित जाति संरचना के रूप में डिजिटोनिन2के साथ मनाया । हालांकि, इस डिटर्जेंट का इस्तेमाल सावधानी से किया जाना चाहिए, क्योंकि डिटर्जेंट/प्रोटीन अनुपात (जैसे, 1 से १.५ g/g) में अपेक्षाकृत छोटी वृद्धि के परिणामस्वरूप SCs विधानसभाओं2का पूर्ण पृथक्करण हो सकता है, जो प्रयोगात्मक विसंगतियों में परिणाम कर सकता है । निष्कर्षण के बाद, नमूनों परंपरागत रूप से coomassie नीले रंग के साथ पूरक है प्रोटीन एक चार्ज देने के लिए जब जेल के लिए लागू, पारंपरिक CN के अलावा-पृष्ठ20,26। Coomassie नीले और अस्थिर प्रोटीन के संभावित पृथक्करण के लिए प्रोटीन जोखिम को कम करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में Coomassie नीले रंग के साथ नमूनों पूरक नहीं हैं ।
वैद्युतकणसंचलन
दोनों CN-पृष्ठ और बीएन-पृष्ठ माइटोकॉन्ड्रियल oxphos परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनमें से प्रत्येक के विशिष्ट लाभ और सीमाएं हैं । मामूली CN-पृष्ठ के तहत इस्तेमाल किया शर्तों (मुख्य रूप से सीबी, जो एक डिटर्जेंट की तरह प्रभाव है की अनुपस्थिति), एटीपी सिंथेज़ में जेल गतिविधि के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, और उच्च आणविक वजन में अस्थिर प्रोटीन के पृथक्करण को सीमित करता है एससी और एटीपी सिंथेस विधानसभाओं26। हालांकि, प्रोटीन निकालने और वैद्युतकणसंचलन बफ़र्स में ऋणायनी डाई सीबी के अभाव प्रोटीन उनके आंतरिक चार्ज और समविभव बिंदु है, जो जेल26के भीतर प्रोटीन की इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता को कम कर देता है के आधार पर विस्थापित करने के लिए कारण बनता है । इसके अलावा, सीबी के अभाव में, अपर्याप्त नकारात्मक चार्ज के साथ प्रोटीन समग्र करने के लिए करते हैं, इस प्रकार जेल20,26में प्रोटीन परिसरों के संकल्प को कम करने । इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, तथाकथित उच्च संकल्प CN-पृष्ठ Wittig और Schragger20द्वारा विकसित किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, सोडियम deoxycholate (डॉक्टर) और विभिंन हल्के गैर ईओण डिटर्जेंट (DDM, Triton X100) कैथोड बफर करने के लिए जोड़ रहे है झिल्ली प्रोटीन और प्रोटीन पर एक नकारात्मक प्रभारी परिवर्तन लागू रखने के लिए, जो एक काफी सुधार में परिणाम 20संकल्प की ।
वर्तमान हाइब्रिड सीएन/बीएन प्रोटोकोल की एक विशिष्ट विशेषता यह है कि इन अपमार्जक के बिना तुलनात्मक विभेदन किया जा सकता है । का क्षणिक अतिरिक्त सीबी कैथोड बफर करने के लिए वैद्युतकणसंचलन की शुरुआत में प्रोटीन एकत्रीकरण की सीमा और जेल में गतिशीलता को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 3 और 4 चित्रा) । नतीजतन, इस संकर तकनीक विशिष्ट अनुसूचित जाति विधानसभाओं के उत्कृष्ट संकल्प और बहुत कम या डिटर्जेंट के लिए कोई जोखिम में सक्षम बनाता है । सीबी की कम मात्रा की उपस्थिति भी CV गतिविधि के बेहतर संरक्षण की अनुमति देता है, द्विभाजक और ओलिमोएरिक CV विधानसभाओं के सुधार संरक्षण (चित्रा 3 और Wittig और Schägger २००५26), और नीले रंग की पृष्ठभूमि शोर की कमी है कि कर सकते है विशेष रूप से सीआईआई और सीआईवी (चित्रा 2) के लिए जेल गतिविधियों में परिमाणीकरण में बाधा । इसके अलावा, प्रोटीन निकालने में सीबी की अनुपस्थिति अनुसूचित जातियों के भीतर अस्थिर प्रोटीन पारस्परिक क्रिया के विघटन को सीमित कर रही है । उदाहरण के लिए, चींटी के साथ एटीपी सिंथेस के शारीरिक संघ ३३ synthasome बनाने के लिए या Cyclophilin-D ptp उद्घाटन ३४ को विनियमित करने के लिए सीबी के अभाव में बेहतर देखा जाता है । इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान सीबी के लिए क्षणिक जोखिम केवल इसलिए अनुसूचित जातियों के भीतर उपंयास प्रोटीन बातचीत प्रकट करने के लिए उपयोगी हो सकता है । कुल मिलाकर, इस संकर CN/ अनुसूचित जातियों के उन्नत विश्लेषण के लिए 2 डी वैद्युत्-संचलन, इम्यूनो-डिटेक्शन और/अथवा प्रोटोमिक्स सहित तकनीकें । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अनुसूचित जातियों के लिए बढ़ती रुचि के साथ, अध्ययन की एक बढ़ती संख्या स्थानीय पृष्ठ के लिए छोटे 10 x 10 सेमी जैल का उपयोग करें । हालांकि इस दृष्टिकोण बहुतायत अनुसूचित जाति विधानसभाओं में सकल परिवर्तन की पहचान करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, छोटे जैल की कम जुदाई क्षमता की संभावना सूक्ष्म पुनर्व्यवस्था का समाधान करने के लिए या proteomic विश्लेषण के लिए अलग बैंड में कटौती करने के लिए सीमित है । इसके अलावा, कई छोटे जैल का उपयोग अध्ययनों से पता चलता है कि respirasome ATPsynthase dimer के रूप में एक ही आकार में माइग्रेट्स, यह मुश्किल22उंहें अलग करना करने के लिए बना । इसलिए, बड़े जैल का उपयोग इष्ट होना चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को तकनीकी सहायता के लिए Jenna Rossi शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और डॉ Mireille Khacho, डॉ डेविड खड़ाऊं और डॉ उज्जवल अनिल कुमार उपयोगी चर्चा के लिए इस पद्धति को विकसित करते हुए । इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों (CIHR) और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग परिषद (NSERC) द्वारा वित्त पोषित किया गया । एसी डॉक्टरेट पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता-फ्रेडरिक बैंटिंग और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति (CIHR) है ।
3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
Acrylamide | Sigma | A3553 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
Imidazole | Sigma | I0250 | |
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |