Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

Summary

Questo lavoro presenta un protocollo per stabilire una coltura di sospensione cellulare derivata dal tè ( Foglie diCamellia sinensis L.) che possono essere utilizzati per studiare il metabolismo di composti esterni che possono essere assorbiti da tutta la pianta, come gli insetticidi.

Abstract

È stata sviluppata una piattaforma per studiare il metabolismo degli insetticidi utilizzando tessuti in vitro della pianta del tè. Foglie da sterili piantagioni di tè sono stati indotti a formare callus sciolto su Murashige e Skoog (MS) mezzi basali con gli ormoni vegetali 2,4-dichlorophenoxyacetic acido (2,4-D, 1.0 mg L^-1) e kinetina (KT, 0.1 mg L^-1). Callus si formò dopo 3 o 4 giri di subcultura, ciascuno della durata di 28 giorni. Il callo sciolto (circa 3 g) è stato poi inoculato in supporti liquidi B5 contenenti gli stessi ormoni vegetali ed è stato coltivato in un'incubatrice agitazione (120 giri/) al buio a 25 gradi centigradi. Dopo 3/4 sottoculture, una sospensione cellulare derivata dalla foglia di tè è stata stabilita in un rapporto di sottocultura compreso tra 1:1 e 1:2 (liquido madre sospensione: mezzo fresco). Utilizzando questa piattaforma, sei insetticidi (5 g mL^-1 ciascuno tiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate e omethoate) sono stati aggiunti nella coltura delle sospensioni cellulari derivata dalla foglia di tè. Il metabolismo degli insetticidi è stato tracciato utilizzando la cromatografia liquida e la cromatografia a gas. Per convalidare l'utilità della coltura delle sospensioni delle cellule del tè, i metaboliti del tiamethoxan e del dimethoate presenti nelle colture cellulari trattate e nelle piante intatte sono stati confrontati utilizzando la spettrometria di massa. Nelle colture trattate di cellule del tè, sono stati trovati sette metaboliti di tiamethoxan e due metaboliti di dimethoate, mentre nelle piante trattate intatte, sono stati trovati solo due metaboliti del tiamethoxam e uno di dimethoate. L'uso di una sospensione cellulare ha semplificato l'analisi metabolica rispetto all'uso di piante da tè intatte, soprattutto per una matrice difficile come il tè.

Introduction

Il tè è una delle bevande analcoliche più consumate al mondo^1,2. Il tè è prodotto dalle foglie e dalle gemme della perenne camellia sinensis L. Tea coltivate in vaste piantagioni e sono suscettibili a numerosi insetti parassiti^3,4. Gli insetticidi organofosforici e neonicotinoidi sono spesso usati come insetticidi sistemici⁵ per proteggere le piante da tè da parassiti come mosche bianche, tramogge di foglie e alcune specie di lepidopteran^6,7. Dopo l'applicazione....

Protocol

1. Cultura del callo del tè

NOTA: Le foglie sterili sono state derivate da linee di plantlet coltivate in vitro sviluppate per la prima volta nel gruppo di ricerca¹⁷. Tutte le procedure fino alla sezione 5 sono state eseguite in una cappa sterile di flusso laminare, ad eccezione del tempo di coltura in un'incubatrice.

1. Regolare il pH dei due supporti (Murashige e Skoog [MS] supporto basale e mezzo liquido B5 di Gamborg) a 5,8 prima dell'autoclaving (121 gradi centigradi, 20 min).
2. Tagliare lungo la vena centrale di una foglia sterile con le forbici, quindi suddividere ogni metà in piccoli pezzi di c....

Results

L'induzione di callo dalle foglie raccolte da alberi da tè coltivati sul campo e da foglie eccitate da piantagioni di tè coltivate in vitro in un ambiente sterile è stata confrontata misurando contaminazione, doratura e induzione dopo 28 giorni di coltivazione su supporti MS ( figura 1A). La crescita del callo è stata registrata a 20, 37, 62 e 90 giorni di cultura (Figura 1B). Il callo derivato dalle foglie coltivate in vitro ha .......

Discussion

Questo articolo presenta il processo dettagliato di definizione di un modello di metabolismo dei pesticidi nel tessuto vegetale del tè, compresa la selezione di espianti, la determinazione della vitalità cellulare e la creazione di una coltura di sospensione delle cellule del tè con alta attività. Qualsiasi parte di un tessuto vegetale potrebbe essere utilizzata per avviare callo in un ambiente sterilizzato²⁵. Le foglie di tè sono state scelte per l'avvio del calloso in questo studio, non solo per.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetamiprid (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	46717	N. CAS: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99,9%)	Tedia	AS1122-801	N. CAS: 75-05-8
Agar	Solarbio Science & Tecnologia	A8190	N. CAS: 9002-18-0
Clothianidin (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	525	N. CAS: 210880-92-5
Dimetoato (98,5%)	Dr. Ehrenstorfer	109217	N. CAS: 60-51-5
Imidacloprid (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	91029	N. CAS: 138261-41-3
Imidaclothiz (99,5%)	Toronto Research Chemical	I275000	N. CAS: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)	Solarbio Scienza & Tecnologia	K8010	N. CAS: 525-79-1
Ometoato (98,5%)	Dr. Ehrenstorfer	105491	N. CAS: 1113-02-6
Polivinilpolipirrolidone (PVPP)	Solarbio Science & Tecnologia	P8070	Numero CAS: 25249-54-1
Saccarosio	Tocris Bioscience	5511	Numero CAS: 57-50-1
Thiamethoxam (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	20625	Numero CAS: 153719-23-4
Cloruro di trifeniltetrazolio (TTC, 98,0%)	Solarbio Science & Tecnologia	T8170	N. CAS: 298-96-4
Acido 2,4-diclorofenossiacetico (2,4-D, >98,0%)	Guangzhou Saiguo Biotech	D8100	N. CAS: 94-75-7
colonna chirale	Agilent CYCLOSIL-B	112-6632	(30 m &volte; 0,25 mm &volte; 0,25 μ m)
Gascromatografia (GC)	Shimadu	2010-Plus	Abbinato a Rivelatore Fotometrico a Fiamma (FPD)
Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)	Agilent	1260	Abbinato a rivelatore ultravioletto (UV)
Colonna HSS T3 C18	Colonna	per cromatografia Waters 186003539	(100 mm & 2,1 mm & 1,8 μ m)
Cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UPLC)	Spettrometro di massa a tempo di volo a quadrupolo tandem	Agilent	1290-6545
Cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UPLC)	Thermo Scientific	Ultimate 3000-Q Exactive Focus	collegato a uno spettrometro di massa Orbitrap