Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"
Summary
Questo lavoro presenta un protocollo per stabilire una coltura di sospensione cellulare derivata dal tè ( Foglie diCamellia sinensis L.) che possono essere utilizzati per studiare il metabolismo di composti esterni che possono essere assorbiti da tutta la pianta, come gli insetticidi.
Abstract
È stata sviluppata una piattaforma per studiare il metabolismo degli insetticidi utilizzando tessuti in vitro della pianta del tè. Foglie da sterili piantagioni di tè sono stati indotti a formare callus sciolto su Murashige e Skoog (MS) mezzi basali con gli ormoni vegetali 2,4-dichlorophenoxyacetic acido (2,4-D, 1.0 mg L-1) e kinetina (KT, 0.1 mg L-1). Callus si formò dopo 3 o 4 giri di subcultura, ciascuno della durata di 28 giorni. Il callo sciolto (circa 3 g) è stato poi inoculato in supporti liquidi B5 contenenti gli stessi ormoni vegetali ed è stato coltivato in un’incubatrice agitazione (120 giri/) al buio a 25 gradi centigradi. Dopo 3/4 sottoculture, una sospensione cellulare derivata dalla foglia di tè è stata stabilita in un rapporto di sottocultura compreso tra 1:1 e 1:2 (liquido madre sospensione: mezzo fresco). Utilizzando questa piattaforma, sei insetticidi (5 g mL-1 ciascuno tiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate e omethoate) sono stati aggiunti nella coltura delle sospensioni cellulari derivata dalla foglia di tè. Il metabolismo degli insetticidi è stato tracciato utilizzando la cromatografia liquida e la cromatografia a gas. Per convalidare l’utilità della coltura delle sospensioni delle cellule del tè, i metaboliti del tiamethoxan e del dimethoate presenti nelle colture cellulari trattate e nelle piante intatte sono stati confrontati utilizzando la spettrometria di massa. Nelle colture trattate di cellule del tè, sono stati trovati sette metaboliti di tiamethoxan e due metaboliti di dimethoate, mentre nelle piante trattate intatte, sono stati trovati solo due metaboliti del tiamethoxam e uno di dimethoate. L’uso di una sospensione cellulare ha semplificato l’analisi metabolica rispetto all’uso di piante da tè intatte, soprattutto per una matrice difficile come il tè.
Introduction
Il tè è una delle bevande analcoliche più consumate al mondo1,2. Il tè è prodotto dalle foglie e dalle gemme della perenne camellia sinensis L. Tea coltivate in vaste piantagioni e sono suscettibili a numerosi insetti parassiti3,4. Gli insetticidi organofosforici e neonicotinoidi sono spesso usati come insetticidi sistemici5 per proteggere le piante da tè da parassiti come mosche bianche, tramogge di foglie e alcune specie di lepidopteran6,7. Dopo l’applicazione, questi insetticidi vengono assorbiti o traslocati nella pianta. All’interno della pianta, questi insetticidi sistemici possono essere trasformati attraverso l’idrolisi, l’ossidazione o le reazioni di riduzione da parte degli enzimi vegetali. Questi prodotti di trasformazione possono essere più polari e meno tossici rispetto ai composti padre. Tuttavia, per alcuni organofosfati, le bioattività di alcuni prodotti sono più elevate. Ad esempio, l’accesata è metabolizzato nel methamidophos più tossico8,9e dimethoate in omethoate10,11. Gli studi metabolici delle piante sono quindi importanti per determinare il destino di un pesticida all’interno di una pianta12.
Le colture di tessuti vegetali si sono dimostrate una piattaforma utile per studiare il metabolismo dei pesticidi, con i metaboliti identificati simili a quelli trovati nelle piante intatte13,14,15. L’uso di colture tissutali, in particolare le colture di sospensioni cellulari, ha diversi vantaggi. In primo luogo, gli esperimenti possono essere effettuati senza microrganismi, evitando così l’interferenza della trasformazione o della degradazione dei pesticidi da parte dei microbi. In secondo luogo, la coltura dei tessuti fornisce materiali coerenti da utilizzare in qualsiasi momento. In terzo luogo, i metaboliti sono più facili da estrarre dalle colture di tessuti che dalle piante intatte, e le colture di tessuti hanno spesso meno composti interring e minore complessità dei composti. Infine, le colture tissutali possono essere utilizzate più facilmente per confrontare una serie di metabolismo dei pesticidi in un singolo esperimento16.
In questo studio, è stata stabilita con successo una sospensione cellulare derivata dalle foglie di piantagione di tè coltivata sterilmente. La coltura delle sospensioni delle celle di tè è stata poi utilizzata per confrontare i comportamenti di dissipazione di sei insetticidi sistemici.
Questo protocollo dettagliato ha lo scopo di fornire alcune indicazioni in modo che i ricercatori possano stabilire una piattaforma di coltura dei tessuti vegetali utile per studiare il destino metabolico degli xenobiotici nel tè.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta il processo dettagliato di definizione di un modello di metabolismo dei pesticidi nel tessuto vegetale del tè, compresa la selezione di espianti, la determinazione della vitalità cellulare e la creazione di una coltura di sospensione delle cellule del tè con alta attività. Qualsiasi parte di un tessuto vegetale potrebbe essere utilizzata per avviare callo in un ambiente sterilizzato25. Le foglie di tè sono state scelte per l’avvio del calloso in questo studio, non sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research & Development Program (2016YFD0200900) della Cina, dalla National Natural Scientific Foundation of China (n. 31772076 e n. 31270728), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) e dall’Open Fund di Laboratorio chiave dello Stato di biologia e utilizzo delle piante di tè (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
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