Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme
Summary
Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Bir video serisi ve onların yörüngeleri posterior analizi üzerinde izleme parçacık günümüzde birçok biyolojik çalışmalarda ortak bir işlemdir. Hücre membran reseptör analizini kullanarak kümeleri bir model olarak, biz bu görüntü analiz görevi, Fiji (ImageJ) ve Matlab rutinleri için kullanarak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut: 1) bölgeleri ilgi tanımlamak ve tasarım bu bölgelere; adapte maskeleri 2) parçacıklar Floresans mikroskobu videoları izlemek; 3) seçili parça Difüzyon ve yoğunluk özellikleri analiz. Kantitatif analiz Difüzyon katsayıları, hareket ve küme boyutu Floresans mikroskobu tarafından elde edilen ve görüntü işleme objektif parçacık dinamiği ve bunun sonuçları belirlemek için değerli bir araç sağlar çevre koşulları. Bu makalede biz bu özellikler analizi için detaylı protokolleri mevcut. Açıklanan yöntemi burada sadece tek molekül izleme algılama, ama aynı zamanda hücre zarı, yanal Difüzyon parametrelerinin tahmini otomatikleştirir, yörünge türünü sınıflandırır ve tam analiz böylece üstesinden sağlar Tüm yörüngesini, hücre zarının üzerinde nokta boyutu miktarının zorluklar.
Introduction
Termal Difüzyon nedeniyle sürekli hareket membran proteinlerinin lipid bilayer gömülü bulunmaktadır. Cins etkileşimleri reaksiyonlar monomerleri boyutu değişir ve kompleksleri sinyal istikrar etkisi kompleksleri oluşumu izin olarak kendi dinamikleri hücre yanıtları, düzenlenmesi için gereklidir. Protein dynamics kontrol mekanizmaları elucidating böylece yeni bir meydan okuma olarak hücre biyolojisi, sinyal iletim yolları anlamaya ve önceden tahmin edilemeyen hücre işlevleri tanımlamak için gerekli olduğunu.
Optik bazı yöntemler geliştirdik bu etkileşimler yaşayan çalışmaya1hücreleri. Bunlar arasında toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi, 1980’lerin başında geliştirilen moleküler etkileşim veya hücre zarı2çok yakınındaki bir çalışma sağlar. Membran protein yörüngeleri yaşayan hücrelerde TIRF veri elde edilen dinamik parametreleri çalışma için tek bir parçacık izleme yöntemini (SPT) gereklidir. Çeşitli algoritmalar bunun için mevcut olmasına rağmen şu anda bu parçacık hareket heterojenite yoğun parçacık alanındaki parçacıklar elde edilen parça bağlanmak için ardışık çerçeveler arasında bağlantı kurarak ele Jaqaman ve ark.3 Yayınevi kullanın kesimleri içine tam yörüngeler (geçici parçacık ortadan kalkması). Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı birleştirme ve bölme sonucunda toplama ve ayrışma olayları3parçacık yakalar. Bu yazılımın çıkış veri algılama tüm yörünge boyunca parçacıkların X ve Y konumlarını her çerçevede tanımlayarak biridir.
Bir kez parçacıkları tespit edilir, kısa timelag Difüzyon katsayısı (D1-4)4,5belirlemek için farklı algoritmaları uygulamak. An ölçekleme spektrum (MSS)6,7,8 analizi uygulayabilir veya ‘Alfa’ değeri ayarlama, ortalama kare deplasman (MSD) eğrisi9tarafından uygun, ayrıca parçacıklar göre sınıflandırmak yörünge türü.
Floresans görüntülerde nokta yoğunluğunu analiz bilim adamları alan10,11‘ deki yönergeleri için paylaşılan bir hedefidir. Parlaklık ve sözde numarası kullanılan en yaygın algoritmasıdır. Bu yöntem yine de doğru kare kare yoğunluğu algılama mobil kesir parçacıklar içinde izin vermez. Böylece, yeni bir algoritma bu parçacık yoğunluklarda çerçevelemek-yanında-çerçevelemek değerlendirmek için ve onların toplama durumu belirlemek için oluşturmuş. Bir kez her parçacık koordinatlarını U-Track2 yazılım3kullanarak tespit edilir, biz şiddeti her çerçevede tam yörünge üzerinde Ayrıca her çerçeve içinde hücre arka planı dikkate alarak tanımlar. Bu yazılım nokta yoğunluğu ve hücre arka planı belirlemek için farklı seçenek sunuyor ve referans olarak bilinen monomeric ve dimerik proteinleri kullanarak tespit parçacık (küme boyutu) proteinler yaklaşık sayısını hesaplar.
Bu makalede, aşağıdaki üç adımı gerçekleştirmek için dikkatli bir rehber tarif: 1) tespit ve floresan mikroskopi U-parça; kullanarak bir video boyunca tek parçacıklar izleme 2) bu parçacıklar ve MSS tarafından uzun yörüngeleri ile parçacıkların hareketi (sınırlı, ücretsiz veya yönlendirilmiş) tip anlık Difüzyon katsayısı (D1-4) analiz; 3) Çeviri: her yer için tahmini arka plan Floresans video boyunca nokta yoğunluğu ölçme. Bu küme boyutu tahmin ve kimlik photobleaching adımları sağlar.
Bu Protokolü’nün kullanılmasına özel beceri gerektirmez ve hücre kültürü ile herhangi bir laboratuarda gerçekleştirilen, Akış Sitometresi ve mikroskopi İmkanları. ImageJ veya Fiji (ImageJ12dağıtım), U-track3ve bazı reklam hoc yapılan rutinleri (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) iletişim kuralını kullanır. U-track ve geçici yordamları uyumlu herhangi bir bilgisayarda yüklü Matlab üzerinden çalışacak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan yöntemi bile Matlab ile çalışan herhangi bir önceki deneyimi kalmadan gerçekleştirmek kolaydır. Ancak, Matlab rutinleri son derece farklı komutlar isimlendirme ve program tarafından istihdam farklı klasörler lokalizasyonu ile doğruluk gerektirir. İzleme çözümlemesi rutin (Adım 3), birden çok parametre değiştirilebilir. “Ayarı Gauss karışım modeli uygun” pencere (Adım 3.8) U-parça videoda tek parçacıkların nasıl algılar denetler. Bu3‘ te açıklandığı …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Carlo Manzo ve Maria García Parajo Difüzyon katsayısı analiz onların yardım ve kaynak kodu için müteşekkiriz. Bu eser kısmen İspanyol bilim Bakanlığı, yenilik ve üniversiteler (SAF 2017-82940-R) gelen hibe tarafından desteklenen ve Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 ve RD16/0012/0006; RETICS programı RIER). LMM ve JV Fundación genel CSIC COMFUTURO program tarafından desteklenir.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
