Billedbehandling protokol for analysen af Diffusion og Cluster størrelse af membranreceptorer af Fluorescens mikroskopi
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for enkelt partikel tracking billedanalyse, der giver mulighed for kvantitative evaluering af diffusion koefficienter, typer af motion og klynge størrelser af én partikler opdaget af Fluorescens mikroskopi.
Abstract
Partiklen tracking på en videosekvens, og de posteriore analyse af deres baner er i dag en fælles operation i mange biologiske undersøgelser. Ved hjælp af analyse af cellens membran receptor klynger som en model, vi præsenterer en detaljeret protokol for dette billede analyse opgave ved hjælp af Fiji (ImageJ) og Matlab rutiner til: 1) definere områder af interesse og designe masker tilpasset til disse regioner; 2) spore partikler i Fluorescens mikroskopi videoer; 3) analysere diffusion og intensitet egenskaber over udvalgte spor. Kvantitativ analyse af diffusion koefficienter, typer af motion, og cluster størrelse fremstillet af Fluorescens mikroskopi og billedbehandling giver et værdifuldt redskab for at objektivt bestemme partikel dynamics og konsekvenserne af ændring miljøforhold. I denne artikel præsenterer vi detaljerede protokoller til analyse af disse funktioner. Metoden beskrevet her ikke kun giver mulighed for enkelt-molekyle inddeling opdagelse, men også automatiserer estimering af lateral diffusion parametre på cellemembranen, klassificerer typen bane og giver mulighed for komplet analyse således at overvinde den vanskeligheder med at kvantificere spot størrelse over dens hele bane på cellemembranen.
Introduction
Membranproteiner indlejret i lipid tolagede er i kontinuerlig bevægelse på grund af termisk diffusion. Deres dynamics er vigtigt at regulere celle svar, da intermolekylære vekselvirkninger tillader dannelsen af komplekser, der varierer i størrelse fra monomerer til oligomerer og påvirke stabiliteten i signalering komplekser. Belyse de mekanismer, der styrer protein dynamics er således en ny udfordring i cellebiologi, nødvendigt at forstå signaltransduktionsveje og identificere uventede cellefunktioner.
Nogle optiske metoder er blevet udviklet til at studere disse interaktioner i levende celler,1. Blandt disse, total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, udviklet i begyndelsen af 1980 ‘ erne, giver mulighed for undersøgelse af molekylære vekselvirkninger på eller meget nær cellemembranen2. For at studere dynamiske parametre af membran protein baner fra JOHANNAS data i levende celler, er et enkelt partikel sporing metode (SPT) påkrævet. Selv om flere algoritmer er tilgængelige for det, bruger vi i øjeblikket dem udgivet af Jaqaman et al.3 , adresse partikel bevægelse heterogenitet i en tætte partikel felt ved at sammenkæde partikler mellem på hinanden følgende frames tilsluttes den resulterende spor segmenter i komplet baner (midlertidig partikel forsvinden). Softwaren indfanger partikel sammenlægning og opsplitning som følge af sammenlægning og dissociation begivenheder3. En af outputdata af denne software er påvisning af partikler langs hele bane ved at definere deres X og Y stillinger i hver ramme.
Når partikler er registreret, anvender vi forskellige algoritmer til at bestemme den korte vender diffusion koefficient (D1-4)4,5. Ved at anvende øjeblik skalering spektrum (MSS)6,7,8 analyse eller ved at montere ‘alpha’ værdien af justering af middelværdi deplacement (MSD) til kurven9klassificere vi også partikler i henhold til typen bane.
Analyse af spot intensitet i fluorescens billeder er et fælles mål for forskere i felt10,11. Den mest almindelige algoritme bruges er den såkaldte antallet og lysstyrke. Denne metode tillader alligevel ikke korrekte frame-by-frame intensitet påvisning i i partikler i den mobile fraktion. Vi har således, genereres en ny algoritme til at vurdere disse partikel intensiteter frame-by-frame og bestemme deres sammenlægning tilstand. Når koordinaterne for hver partikel er registreret ved hjælp af U-Track2 software3, definerer vi dens intensitet i hver ramme over komplet bane, også under hensyntagen til cellebaggrunden i hver ramme. Denne software tilbyder forskellige muligheder for at bestemme den spot intensitet og cellebaggrunden og ved hjælp af kendte monomere og dimerisk proteiner som referencer, beregner det omtrentlige antal proteiner i partikel opdaget (cluster størrelse).
I denne artikel vil vi beskrive en grundig guide til at udføre disse tre trin: 1) påvisning og sporing én partikler langs en video af Fluorescens mikroskopi ved hjælp af U-spor; 2) analyserer den øjeblikkelige diffusion koefficient (D1-4) af disse partikler og typen af bevægelsen (begrænset, gratis eller styret) af partikler med lange baner af MSS; 3) måling af spot intensiteten langs videoen korrigeret af de anslåede baggrund fluorescens af hver plet. Dette giver mulighed for klynge størrelse vurdering og identifikation af photobleaching trinene.
Anvendelse af denne protokol kræver ikke specialiserede færdigheder og kan udføres på et laboratorium med cellekultur, flow flowcytometri og mikroskopi faciliteter. Protokollen bruger ImageJ eller Fiji (en distribution af ImageJ12), U-track3, og nogle ad hoc-lavet rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-bane og ad hoc-rutiner kørt over Matlab, som kan installeres på enhver kompatibel computer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne metode er let at udføre selv uden at have nogen tidligere erfaring med Matlab. Matlab rutiner kræver imidlertid meget nøjagtighed med nomenklaturen for de forskellige kommandoer og lokalisering af de forskellige mapper ansat af programmet. I sporing analyse rutine (trin 3), flere parametre kan ændres. Vinduet “Indstilling Gaussisk-blanding Model Fitting” (trin 3.8) styrer, hvordan U-bane vil opdage én partikler på video. Dette gøres ved at montere en Gaussisk blanding model som beskrevet i<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Carlo Manzo og Maria García Parajo for deres hjælp og kilde kode af diffusion koefficient analyse. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra den spanske Ministeriet for forskning, Innovation og universiteter (SAF 2017-82940-R) og RETICS Program af Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 og RD16/0012/0006; RE). LMM og JV understøttes af programmet COMFUTURO af Fundación General CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
