Protokoll för bildbehandling för analys av diffusionen och klusterstorleken av membranreceptorer av fluorescensmikroskopi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för enskild partikel spårning bildanalys som tillåter kvantitativ utvärdering av Diffusionskoefficienterna, typer av rörelse och klustret storlekar av enstaka partiklar upptäcks av fluorescensmikroskopi.
Abstract
Partikel spårning på en videosekvens och bakre analys av deras banor är numera en gemensam operation i många biologiska studier. Med hjälp av analys av cellmembranet receptorn kluster som modell, vi presenterar ett detaljerat protokoll för denna bild analys uppgift med hjälp av Fiji (ImageJ) och Matlab-rutiner för att: 1) definiera områden av intresse och design masker anpassas till dessa regioner. (2) spåra partiklar i fluorescence mikroskopi videor; (3) analysera diffusion och intensitet kännetecknar valda spår. Den kvantitativa analysen av Diffusionskoefficienterna, typer av rörelse och cluster storlek erhålls genom fluorescensmikroskopi och bildbehandling ger ett värdefullt verktyg för att objektivt fastställa partikel dynamics och konsekvenserna av att ändra miljöförhållanden. I denna artikel presenterar vi detaljerade protokoll för analys av dessa funktioner. Den metod som beskrivs här inte bara tillåter singel-molekyl spårning upptäckt, men också automatiserar uppskattning av lateral diffusion parametrar på cellmembranet, klassificerar typ av bana och tillåter fullständig analys således att övervinna den svårigheter att kvantifiera strålpunkt över dess hela bana på cellmembranet.
Introduction
Membranproteiner inbäddad i den lipid lipidens är i kontinuerlig rörelse på grund av termisk diffusion. Deras dynamik är viktiga att reglera cell svaren, som intermolekylära växelverkningar tillåta bildandet av komplexen som varierar i storlek från monomers att Oligomerer och påverka stabiliteten i signalering komplex. Klarlägga de mekanismer som styr protein dynamics är således en ny utmaning i cellbiologi, nödvändigt att förstå cellsmedierade reaktioner och identifiera oförutsedda cellfunktioner.
Vissa optiska metoder har utvecklats att studera dessa interaktioner i levande celler1. Bland dessa tillåter Totalreflexion (Frida) fluorescensmikroskopi, utvecklades i början av 1980, studier av molekylära interaktioner på eller mycket nära den cellmembran2. För att studera dynamiska parametrar av membran protein banor från Frida data i levande celler, krävs en enda partikel spårning metod (SPT). Även om flera algoritmer finns för detta, använder vi för närvarande de som publicerats av Jaqaman et al.3 som adress partikel motion heterogenitet i en tät partikel-fältet genom att länka partiklar mellan bildrutor att ansluta resulterande banan segment i kompletta banor (tillfällig partikel försvinnande). Programvaran fångar partikeln sammanslagning och uppdelning som leder från aggregering och dissociation händelser3. En av utdata av denna programvara är detektion av partiklar längs hela banan genom att definiera sin X och Y positioner i varje bildruta.
När partiklar upptäcks, tillämpar vi olika algoritmer för att avgöra den korta valutakursändringen diffusion koefficient (D1-4)4,5. Genom den ögonblick skalning spektrum (MSS)6,7,8 analysen eller passande ‘alpha’ värdet vid justering av de Mean Square deplacement (MSD) till kurva9, klassificera vi också partiklarna enligt typ av bana.
Analys av spot intensitet i fluorescens bilder är en gemensam målsättning för forskare i fältet10,11. Den vanligaste algoritm som används är så kallade nummer och ljusstyrka. Denna metod ändå tillåter inte rätt bildruta-för-bildruta intensitet upptäckt i partiklar i mobila fraktionen. Vi har, således, genereras en ny algoritm att utvärdera dessa partikel stödnivåer bildruta-för-bildruta och avgöra deras aggregation tillstånd. När koordinaterna för varje partikel upptäcks med hjälp av U-Track2 programvara3, definiera vi dess intensitet i varje ram över hela banan, också med hänsyn till cellbakgrund i varje ram. Denna programvara erbjuder olika möjligheter för att bestämma den plats intensiteten och Cellbakgrund och använda kända monomer och dimeriskt proteiner som hänvisningar, beräknar det ungefärliga antalet proteiner i partikel upptäckt (cluster storlek).
I den här artikeln beskriver vi en försiktig guide för att utföra dessa tre steg: 1) att upptäcka och spåra enstaka partiklar längs en video av fluorescensmikroskopi använder U-spår; (2) analysera den momentana diffusionskoefficienten (D1-4) av dessa partiklar och vilken typ av rörelse (trånga, fri eller dirigerad) av partiklar med långa banor av MSS; (3) mätning spot intensiteten längs videon korrigeras genom den uppskattade bakgrund fluorescensen för varje plats. Detta tillåter kluster storlek uppskattning och identifiering av fotoblekning steg.
Användning av detta protokoll kräver inte specialkunskaper och kan utföras i ett laboratorium med cellkultur, flow flödescytometri och mikroskopi. Protokollet används ImageJ eller Fiji (en fördelning av ImageJ12), U-spår3och några ad hoc gjort rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-spår och ad hoc-rutiner köra över Matlab som kan installeras i valfri kompatibel dator.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna metoden är lätt att utföra även utan någon tidigare erfarenhet av arbete med Matlab. Matlab-rutiner kräver dock extremt noggrannhet med nomenklaturen av olika kommandon och lokalisering av de olika mapparna som används av programmet. I spårning analys rutin (steg 3), flera parametrar kan ändras. Fönstret ”inställningen Gaussian-blandning modell passande” (steg 3.8) styr hur U-spår kommer att upptäcka enstaka partiklar på videon. Detta görs genom att montera en Gaussisk blandning modell so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att Carlo Manzo och Maria García Parajo för deras hjälp och källa koden av diffusion koefficient analysen. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från det spanska ministeriet för vetenskap, Innovation och universitet (SAF 2017-82940-R) och RETICS programet av det Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 och RD16/0012/0006; RIER). LMM och JV stöds av programmet COMFUTURO av den Fundación General CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
