In vitro-mikronukleusanalysen er en veletableret metode til vurdering af genotoksicitet og cytotoksicitet, men det er besværligt at score analysen ved hjælp af manuel mikroskopi, og den lider under subjektivitet og variabilitet mellem scorer. Dette dokument beskriver den protokol, der er udviklet til at udføre en fuldt automatiseret version af analysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri.
In vitro mikronukleustest (Mn) assay bruges ofte til at evaluere cytotoksicitet og genotoksicitet, men at score analysen via manuel mikroskopi er omstændelig og introducerer usikkerhed i resultaterne på grund af variabilitet mellem scorere. For at afhjælpe dette, automatiseret slide-scanning mikroskopi samt konventionelle flow flowcytometri metoder er blevet indført i et forsøg på at fjerne målscorer bias og forbedre gennemløb. Men, disse metoder har deres egne iboende begrænsninger såsom manglende evne til at visualisere cytoplasmaet i cellen og manglen på visuel MN verifikation eller billede datalagring med flow cytometry. Multispectral imaging flow cytometry (MIFC) har potentialet til at overvinde disse begrænsninger. MIFC kombinerer den høje opløsning fluorescerende billeder af mikroskopi med den statistiske robusthed og hastighed af konventionel flow cytometri. Desuden kan alle indsamlede billeder gemmes i dosis-specifikke filer. Dette dokument beskriver den protokol, der er udviklet til at udføre en fuldt automatiseret version af MN-analysen på MIFC. Humane lymfoblastoid TK6 celler blev forstørret ved hjælp af en hypotonisk opløsning (75 mM KCl), fikseret med 4% formalin, og det nukleare indhold blev plettet med Hoechst 33342. Alle prøver blev kørt i suspension på MIFC, hvilket muliggør erhvervelse af billeder i høj opløsning af alle vigtige hændelser, der kræves til analysen (f. eks. binucleerede celler med og uden MN samt mononukleerede og polynucleerede celler). Billeder blev automatisk identificeret, kategoriseret og optalt i MIFC data analysis software, der giver mulighed for automatiseret scoring af både cytotoksicitet og genotoksicitet. Resultaterne viser, at brug af MIFC til at udføre in vitro-MN-analysen gør det muligt at påvise statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen på flere forskellige niveauer af cytotoksicitet sammenlignet med solvenskontrol efter eksponering af TK6 celler for at Mitomycin C og colchicin, og at der ikke observeres signifikante stigninger i MN-frekvensen efter eksponering for Mannitol.
In vitro-mikronukleus (Mn)-analysen er en almindeligt anvendt test til vurdering af cytotoksicitet og genotoksicitet som et screeningsværktøj i flere studieområder såsom kemisk og farmaceutisk udvikling samt Human bioovervågning blandt personer, der udsættes for forskellige miljømæssige, erhvervsmæssige eller livsstilsfaktorer1,2,3. MN består af kromosom fragmenter eller hele kromosomer genereret under celledeling, der ikke er indarbejdet i en af de to vigtigste datter kerner. Efter telophase, dette kromosomale materiale former i en individuel, afrundet krop inde i cytoplasmaet, der er adskilt fra en af de vigtigste kerner2. Derfor er MN repræsentative for DNA-skader og har været anvendt i mange år som et endepunkt i genotoksicitetstest4. Den mest hensigtsmæssige metode til at måle MN er Cytokinesis-Block mikronukleustest (cbmn) assay. Ved anvendelse af CBMN-analysen kan hyppigheden af MN i binucleerede celler (Bnc’er) scores ved at indarbejde Cytochalasin B (Cyt-B) i prøven. Cyt-B tillader nuklear division, men forhindrer cellulær division og dermed begrænser scoring af MN til Bnc’er, der kun har delt en gang5.
Protokoller, der anvender både mikroskopi og flowcytometri, er blevet udviklet og valideret og anvendes rutinemæssigt til at udføre in vitro-MN-analysen6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Mikroskopi fordele ved at være i stand til visuelt at bekræfte, at MN er legitime, men er tidskrævende og tilbøjelige til variation mellem scorers15. For at løse dette, automatiseret mikroskopi metoder blev udviklet til at scanne slides og fange billeder af kerner og MN16,17,18,19, men cytoplasmaet kan ikke visualiseres, hvilket gør det vanskeligt at afgøre, om en MN faktisk er forbundet med en bestemt celle. Desuden har disse metoder svært ved at identificere polynucleerede (POLY) celler (herunder Tri-og kvadranucleerede celler), som er nødvendige for beregningen af cytotoksicitet ved brug af Cyt-B9. Flowcytometri-metoder udviklet til at udføre MN-analysen beskæftiger fluorescens samt fremad-og side scatter intensiteter for at identificere populationer af både kerner og MN, der er blevet befriet fra cellen efter lysis20,21 ,22. Dette gør det muligt at erhverve data fra flere tusinde celler i et par minutter og tillader automatiseret analyse23; men den manglende evne til at visualisere cellerne gør det umuligt at bekræfte, at scoret begivenheder er ægte. Desuden, lyserende cellemembranen hæmmer brugen af Cyt-B samt skabe en suspension, der indeholder andre rester såsom kromosom aggregater eller apoptotiske organer, og der er ingen måde at differentiere disse fra MN24.
I lyset af disse begrænsninger er multispectral imaging flow cytometry (MIFC) et ideelt system til at udføre MN-analysen, da det kombinerer de fluorescerende billeder i høj opløsning af mikroskopi med den statistiske robusthed og hastighed af konventionel strømnings cytometri. I MIFC introduceres alle celler i et fluidics-system og er derefter Hydrodynamisk fokuseret ind i midten af en flowcelle kuvette. Ortogononal belysning af alle celler opnås ved hjælp af en lysfelt (BF) lysemitterende Diode (led), en side scatter laser og (mindst) en fluorescerende laser. Fluorescerende fotoner er fanget af en af tre (20x, 40x eller 60x) høje numeriske blænde objektiv linser og derefter passere gennem en spektral nedbrydning element. Fotoner er derefter fokuseret på et oplader-koblet Device (CCD) kamera for at opnå høj opløsning billeder af alle celler, der passerer gennem flowcellen. For at undgå sløring eller striber fungerer CCD i tilstanden for tidsforsinket integration (TDI), som sporer objekter ved at overføre pixel indhold fra række til række ned i CCD i synkry med hastigheden af cellen i flow. Pixeloplysninger indsamles derefter fra den sidste række af pixel. TDI Imaging kombineret med spektral nedbrydning tillader op til 12 billeder (2 BF, 10 fluorescerende) at blive fanget samtidigt fra alle celler, der passerer gennem flowcellen. Alle optagne billeder gemmes i eksempel specifikke datafiler, hvilket gør det muligt at foretage analyser når som helst ved hjælp af MIFC-dataanalyse softwaren. Endelig bevarer datafiler forbindelsen mellem celle billeder og prikker på alle bivariate plots. Det betyder, at enhver prik på en traditionel bivariate plot kan fremhæves, og dens tilsvarende BF og fluorescerende billeder vil blive vist25.
For nylig er mifc-baserede metoder blevet udviklet til at udføre MN-analysen for både triage stråling biodosimetri26,27,28,29,30,31 og genetisk toksikologi32,33 testning. Dette arbejde har vist, at cellulære billeder af de vigtigste kerner, MN og cytoplasmaet kan afbildet med højere gennemløb end andre metoder26. Alle celletyper, der kræves til analyse, herunder MONO celler, Bnc’er (med og uden MN) og POLY-celler, kan automatisk identificeres i MIFC-dataanalyse softwaren, og implementeringen af scorings kriterierne udviklet af Fenech et al. opnås gennem brugen af forskellige matematiske algoritmer6,34. Resultaterne fra biodosimetri viste, at kalibreringskurverne for dosisrespons var af samme størrelsesorden som dem, der blev opnået fra andre automatiserede metoder i litteraturen ved kvantificering af MN pr. BNC29. Desuden har det seneste arbejde inden for toksikologi påvist, at billeder af MONO celler, Bnc’er (med og uden MN) og POLY-celler automatisk kan optages, identificeres, klassificeres og optælles ved hjælp af MIFC. Protokollen og dataanalysen gjorde det muligt at beregne cytotoksicitet og genotoksicitet efter at have udsat TK6 celler for flere clastogener og aneugener32.
Den protokol, der præsenteres i dette dokument, beskriver en metode til at udføre in vitro-MN-analysen med MIFC. Den prøve forarbejdningsteknik, der anvendes i dette arbejde, kræver mindre end 2 timer til at behandle en enkelt prøve og er relativt let at udføre i forhold til andre metoder. Dataanalysen i MIFC-analysesoftwaren er kompliceret, men oprettelsen af analyse skabelonen kan udføres i et par timer efter de trin, der er skitseret i dette papir. Desuden, når skabelonen er blevet oprettet, kan den automatisk anvendes på alle indsamlede data uden yderligere arbejde. Protokollen skitserer alle trin, der kræves for at eksponere TK6 celler til clastogens og aneugens, beskriver, hvordan man kultur, proces og pletter cellerne, og demonstrerer, hvordan man erhverver billeder i høj opløsning ved hjælp af MIFC. Desuden illustrerer dette dokument den nuværende bedste praksis for analyse af data i MIFC-software til automatisk at identificere og score MONO celler, Bnc’er og POLY-celler med henblik på at beregne både cytotoksicitet og genotoksicitet.
I en nylig publikation har Verma et al. understreget vigtigheden af at udvikle et system, der kombinerer fordelen ved flow cytometri med høj gennemløb med data-og billed lagrings fordelene ved billedanalyse35. MIFC in vitro-MN-analysen, der er beskrevet i dette dokument, opfylder dette citat og har potentialet til at overvinde mange af de førnævnte udfordringer i mikroskopi og flow cytometri metoder. Den protokol, der er beskrevet her, viser, at både cytotoksicitet og genotoksicitet kan evalueres ved hjælp af MIFC. Prøveforberedelse, cellulær farvning og dataindsamling er ligetil, men der er nogle kritiske trin i protokollen, der bør altid gennemføres. Tilsætning af kaliumchlorid (KCl) til cellerne er afgørende for at svulme cellerne, genererer adskillelse mellem de vigtigste kerner. Dette sikrer, at maskering algoritme kan identificere alle individuelle kerner i BNCs og POLY celler (POLY celler), som er nødvendige for deres optælling. Derudover giver KCL adskillelse mellem kerner og MN, hvilket er afgørende for nøjagtig MN-maskering og kvantitation. Desuden forhindrer anvendelsen af formalin efter tilsætning af KCl celler i at lyserende under centrifugering. Tilsætning af Cytochalasin B forårsager TK6 celler, der har gennemgået mere end én nuklear division at være ganske store. Som et resultat, cytoplasmaet bliver skrøbelig og kan lyse, hvis centrifugering udføres umiddelbart efter tilsætning af KCl. Desuden er det meget vigtigt at introducere Hoechst til stikprøven i henhold til antallet af celler i stikprøven og ikke efter en endelig koncentration. F. eks. vil en endelig koncentration på 10 μg/mL af Hoechst på en ensartet måde plette en prøve på 1 x 106 celler, men kan ikke i tilstrækkelig grad plette en prøve indeholdende 5 x 106 celler og kan resultere i mange celler med svagt farvede kerner, hvilket gør analysen vanskelig. Det er også vigtigt at bemærke, at Hoechst kan udskiftes med et andet DNA-farvestof som DAPI, hvis MIFC er udstyret med 405 nm excitation laser eller DRAQ5, hvis MIFC er udstyret med 488 nm og/eller 642nm excitation laser (s). Hvis du ændrer den nukleare plet, er det afgørende at titrere pletten for at finde den passende koncentration til den ønskede/ønskede laser effekt.
Ved indsamling af data på MIFC er det vigtigt at bestemme de optimale område grænser for gradient RMS-funktionerne. De grænser, der præsenteres i denne protokol, kan kræve justering på grund af nogle små variationer mellem MIFC-instrumenterne. Anvendelsen af denne funktion under dataindsamling er afgørende for at sikre, at meget fokuserede billeder er fanget. Hvis datafiler indeholder mange slørede eller ufokuserede billeder, er det sandsynligt, at maske algoritmerne i analysesoftwaren fejlagtigt vil fremhæve farvnings artefakter i de slørede områder, hvilket fører til et stort antal falske positive artefakter, der bliver scoret som MN. Selv om de billedbehandling teknikker, der er beskrevet her kan være svært, når en analyse skabelon er blevet udviklet i MIFC software, batchbehandling giver mulighed for datafiler, der skal analyseres automatisk, eliminere brugerintervention og derfor, scorer Bias. Også, hvis en anden cellelinje end TK6 celler bruges til at udføre analysen, vil det være nødvendigt at ændre masker og område grænser som de morfologiske egenskaber (f. eks størrelse) af celler vil afvige fra de TK6 celler.
De resultater, der præsenteres her (figur 5), viser statistisk signifikante STIGNINGER i MN-induktion, når TK6 celler eksponerer for forskellige doser af Mitomycin C og colchicin. Der blev observeret statistisk signifikante stigninger i hyppigheden af MN i forhold til opløsningsmiddel kontrol for flere doser i begge kemikalier. Desuden inducerede ingen dosis mannitol en cytotoksicitet på over 30% eller en statistisk signifikant stigning i hyppigheden af MN sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol som forventet. Den protokol, der er beskrevet i dette papir ved hjælp af MIFC til at udføre in vitro MN-analysen, giver forventede resultater fra både positive og negative kontrol kemikalier. Det er meget vigtigt at udføre en række eksperimenter ved hjælp af både opløsningsmiddel kontrol og negative kontrol kemikalier til at udvikle baselineværdier af både hyppigheden af MN samt Cytokinesis blok proliferation Index (CBPI). For genotoksicitet bestemmes statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen ved sammenligning med baseline MN-frekvenser, som skal være velkendte for den anvendte celletype. Desuden er alle cytotoksicitets beregninger baseret på CBPI af kontrolprøverne, og derfor skal basis satserne for MONO, BNCs og POLY celler være velkvantificerede i kontrollerne.
Flere begrænsninger og fordele ved at bruge mifc i forbindelse med MN-analysen er beskrevet i tidligere arbejde29,32. De vigtigste begrænsninger vedrører lavere MN-frekvenser i forhold til mikroskopi, hvilket formentlig skyldes både den manglende fleksibilitet ved gennemførelsen af scorekriterierne i analysesoftwaren samt den begrænsede dybde af feltet i MIFC. Velkurvede masker kan oprettes for præcist at identificere de vigtigste kerner, men MN, der rører (eller meget tæt på) de vigtigste kerner kan blive fanget i BNC masken. Desuden er meget små MN, der kan være temmelig let scoret ved hjælp af mikroskopi sandsynligvis fejlagtigt savnet, når du bruger MIFC på grund af den nedre grænse på området parameter af MN masken for at undgå at score små artefakter. Ud over de vanskeligheder i image-baserede dataanalyse, på grund af dens design, MIFC opnår to dimensionelle projektion billeder af tredimensionelle cellulære objekter. Dette sandsynligvis forårsager nogle MN at blive fanget i en anden dybde af fokus, at de to vigtigste MN, hvilket gør dem synes meget Dim og un-scorable ved hjælp af maskering. Desuden kunne en lille brøkdel af MN opholde sig bag en af de to vigtigste kerner, hvilket gør dem umulige at visualisere og score. I betragtning af disse vanskeligheder bør der derfor udvises forsigtighed ved tolkning af signifikante stigninger i MN-frekvensen ved lave doser.
På trods af disse mangler, MIFC metode beskrevet her giver flere fordele i forhold til andre teknikker. Fenech et al. foreslåede kriterier og retningslinjer, der bør tages i betragtning ved udvikling af automatiserede systemer og metodologier for MN assays36. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, direkte visualisering af de vigtigste kerner og cytoplasma, bestemmelse af hyppigheden af MN fra forskellige doser af den kemiske eller agens, der testes, og evnen til at kvantificere morfologi og bestemme positionen af alle kerner og MN for at sikre, at de er inden for cytoplasmaet. Dette dokument viser, at MIFC-metoden, der er udviklet til at udføre in vitro-MN-analysen, opfylder disse kriterier (eller besidder potentialet til at opfylde). Specifikt kan billeder af kerner og MN optages af fluorescerende lasere, mens cytoplasmiske billeder kan opnås ved hjælp af BF LED. Billeder af celler med normal nuklear morfologi kan automatisk skelnes fra de celler med uregelmæssige morfologi ved hjælp af en kombination af avancerede masker og funktioner. De resultater, der præsenteres for colchicin og Mitomycin C (figur 5), viser, at både genotoksicitet og cytotoksicitet kan vurderes ved forskellige doser sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol, og at der observeres statistisk signifikante MN-frekvenser, hvor Forventede. Desuden anbefaler OECD Test Guideline 487 at score 2.000 Bnc’er pr. testkoncentration for at vurdere tilstedeværelsen af MN til bestemmelse af genotoksicitet sammen med mindst 500 celler pr. testkoncentration for at bestemme cytotoksicitet9; Dette kan tage over 1 time ved hjælp af manuel mikroskopi. Protokollen og resultaterne i dette dokument viser, at et gennemsnit på omkring 6.000 BNCs, 16.000 MONO celler, og 800 POLY celler blev fanget og scoret pr testkoncentration i omkring 20 min. Den hurtige dataindsamling og det høje antal af kandidat celler, der er scoret på så kort tid, fremhæver en anden vigtig fordel ved at ansætte MIFC til at udføre in vitro-MN-analysen.
Mens de resultater, der præsenteres i dette dokument er opmuntrende, de er repræsentative for en tidlig proof-of-koncept metode. Dette arbejde bør følges op af en mere grundig undersøgelse af et større, mere mangfoldigt kemikalie sæt, der dækker flere klasser og mekanismer for genotoksicitet og cytotoksicitet, såsom dem, der er foreslået af Kirkland et al.37 gennemførelse af sådanne undersøgelser er tidskrævende og arbejdskraftintensiv, og falder uden for rammerne af dette papir men disse større skala undersøgelser vil give værdifuld indsigt i metodens evne til pålideligt at identificere svagt genotoksiske midler. Den metode, der præsenteres her, er endnu ikke blevet miniaturiseret til et strips med mikrobrønde-format, hvilket ville muliggøre en hurtigere og mere effektiv screening på tværs af et større dosisområde. Som sådan, i sin nuværende form, den MIFC-baserede in vitro MN assay præsenteret her kan være bedst egnet til arbejdsintensive opfølgende undersøgelser eller forskning i god laboratoriepraksis. Metoden vil dog fortsat blive optimeret og valideret og har potentialet til at give mulighed for øget fleksibilitet i forbindelse med påvisning af kemiske specifikke hændelser relateret til morfologi, såsom eksponering af aneugen, der øger andelen af celler med ikke-cirkulære kerner, der stadig er scorbare38. Endelig giver MIFC-metoden mulighed for at introducere yderligere biomarkører i MN-analysen (f. eks. kinetochore-farvning) for at give et mere omfattende overblik over mekanismen for MN-induktion.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren tak Christine Probst (Luminex Corporation) for hendes bestræbelser på at udvikle tidligere former for dataanalyse skabelon, samt Dr. Haley Pugsley (Luminex Corporation) og Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) til gennemgang og redigering af Manuskript.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 um filter, 500 mL bottle |
Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
Debubbler – 70% Isopropanol | EMD Millipore | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | EMD Millipore | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS | EMD Millipore | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
MIFC software – INSPIRE | EMD Millipore | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
NEAA Mixture 100X | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | EMD Millipore | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | EMD Millipore | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T25 flask | Falcon | 353109 | |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |