Daglig fototerapi med rødt lys Regulate Candida albicans Biofilm vekst
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere utfallet av rødt lys program på vekst av Candida albicans biofilm. En ikke-sammenhengende rødt lys enhet med bølgelengden til 635 nm og energi tetthet av 87.6 J·cm-2 ble brukt gjennom vekst av Candida albicans biofilm for 48 timer.
Abstract
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere utfallet av kostgodtgjørelse rødt lys behandling på veksten av Candida albicans biofilm. For å øke planktoniske veksten av C. albicans SN425, vokste inoculums på gjær Nitrogen Base media. For biofilm formasjon, ble RPMI 1640 media, som har høye konsentrasjoner av aminosyrer, brukt til å hjelpe biofilm vekst. Biofilm 48 h ble behandlet to ganger om dagen for en periode på 1 min med en ikke-sammenhengende lys enhet (rødt lys, bølgelengde = 635 nm; energi tetthet = 87.6 J·cm-2). Som en positiv kontroll (PC), 0,12% chlorhexidine (CHX) ble brukt, og som en negativ kontroll (NC), 0.89% NaCl ble brukt av biofilm. Kolonien danner enheter (CFU), tørr vekt, løselig og uløselig exopolysaccharides kvantifisert etter behandlinger. Kort, protokollen presenteres her er enkel, reproduserbare og gir svar om levedyktighet, tørr vekt og ekstracellulære polysakkarid beløp etter rødt lys behandling.
Introduction
Den økte forekomsten av diabetes, suppressive musikkterapi anvendelser, HIV-smitte, AIDS-epidemien, invasiv kliniske prosedyrer og bredspektret antibiotika forbruk i de siste årene har økte forekomsten av Candida albicans relaterte sykdommer1,2. C. albicans infeksjoner er vanligvis knyttet til biofilm utvikling og kan forårsake kliniske manifestasjoner, som candidiasis eller systemisk manifestasjoner, for eksempel candidemia1,2. En av de mest bemerkelsesverdige virulens faktorene biofilm vekst er ekstracellulære polysakkarid matrix etablering. Biofilm formasjon samarbeider for å øke motstanden mot eksisterende antifungal medisiner, miljøbelastning og vert immun mekanismer3.
Biofilm veksten av C. albicans begynner med tidlig tilslutning planktoniske celleområde til et substrat etterfulgt av spredning av gjærceller gjennom substrat overflate og hyphal vekst. Den siste fasen av biofilm vekst er modning fase, der gjær-lignende utvikling er undertrykt hyphal utviklingen utvider og den ekstracellulære matrisen omslutter biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrisen samhandle for å danne mannan – Glukan komplekse5,6. Samspillet av exopolysaccharides er avgjørende for forsvaret av biofilm mot narkotika7. Derfor kan reduksjon av EPS C. albicans ekstracellulær matrix støtte utviklingen av nye antibiofilm protokoller for muntlig candidiasis kontroll.
Lys regulerer vekst, utvikling og atferd av flere organismer8 , og det har vært brukt som en antimikrobiell i Fotodynamisk antimikrobiell kjemoterapi (pakt). PAKTEN gjelder en synlig lys av en bestemt bølgelengde og en lys-absorberende photosensitizer9. Men har photosensitizers vanskeligheter i gjennomtrengende biofilm, forårsaker lavere effekt10. Svikt i terapeutisk agenter å fullt infiltrere biofilm er en grunn til at biofilm sporadisk motstå tradisjonell antimikrobielle terapi3,5. For å deaktivere vedlagte mikrobiell cellene, må poesi aksent gjennomsyre gjennom ekstracellulær matrix; likevel karakteriserer EPS et diffusional hinder for slike molekyler ved å spørre deres nivå av transport inn i biofilm eller påvirke responsen av antimikrobielle med matrix seg11.
Vurderer ulempene av PAKTEN, bruk av lys selv fremstår som en verdifull forbedring. Foreløpige data viste at behandling med blå lys to ganger om dagen betydelig hemmet produksjonen av EPS-uløselig i Streptococcus mutans biofilm. Ved reduksjon av EPS-uløselig, blått lys redusert biofilm vekst. Likevel er utfallet av lysbehandling bruker rødt lys i C. albicans biofilm knappe. Dermed var målet med undersøkelsen å evaluere i hvilken måte fototerapi bruker rødt lys påvirker vekst og ordning av C. albicans biofilm. For to ganger daglig behandling, vi tilpasset vårt laboratorium tidligere protokoller9,12 for å gi en lett og reproduserbar biofilm modell som leverer svar om levedyktighet, tørr vekt og ekstracellulære polysakkarider beløpene etter rødt lys behandling. Samme protokoll kan brukes for å teste andre terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
De viktigste trinnene for vellykket dyrking av C. albicans biofilm er: 1) å gjøre det før inoculum og inoculum i YNB medium supplert med 100 mM glukose; 2) til 90 min venter vedheft fasen og nøye vask dobbelt brønnene 0.89% NaCl fjerne ikke overholdt celler. og 3) til RPMI medium til adhered cellene å starte biofilm formasjon, siden RPMI vil stimulere hyfer vekst. Aneuploidies kan oppstå når dyrking C. albicans. Det er derfor viktig ikke å bruke kolonier som er mer enn syv dager gammel, ikke ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal og Dr. Iriana Zanin for utvikling av denne studien. Vi erkjenner også Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) for å donere belastningen analysert i denne studien.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
