エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動
Summary
ここでは、チアゾール オレンジをゲル電気泳動の実験で DNA の検出に使用するプロトコルを提案する.チアゾール オレンジの使用により、エチジウム ブロマイド除去、紫外線や青色光を蛍光検出を実現できます。
Abstract
アガロースゲルを用いた DNA 電気泳動は、サイズによる DNA のフラグメントの分離が可能分子生物学研究所で一般的なツールです。分離後、DNA は汚損によって視覚化です。この記事は、チアゾール オレンジ染色する DNA を使用する方法を示します。チアゾール オレンジは一般的な染色方法を好意的に比較し、機密性の高い、安価な紫外線やブルーライト (サンプル破損しないように)、興奮、エチジウム ブロマイドよりも安全です。臭化エチジウムを用いた DNA 電気泳動実験を実行する、既に設置されて研究所一般に検出の UV ライトを使用して、既存のプロトコルを追加変更なしで染料を切り替えることができます。サンプルの損傷を防ぐため青色光検出は、青の光のソースと排出フィルターでさらに実現できます。青色光検出のため、既に設置されて研究所単に既存のプロトコルを追加変更なしで染料を切り替えることができます。
Introduction
このメソッドの目的は、チアゾール オレンジ (する) を使用して蛍光検出のための agarose のゲルの DNA を識別するためにです。その低コスト、良好な安全性プロファイルのためチアゾール オレンジが学部教育研究所と研究所分子生物学、特にをおよびクローン作成を実行することで特定の利点を参照してください。
臭化エチジウムのまま agarose のゲルの DNA の検出のための最も一般的な染料です。それは非常に安価で得ることができる主な理由で、検出のため紫外線で励起を必要なだけ。両方のエチジウム ブロマイドとチアゾール オレンジが低い検出限界 (1-2 ng/車線)1で、高価ではありません。チアゾール オレンジをさらに強化、ただし、エチジウム ブロマイドに 2 つの主な欠点があります。
まず、エチジウム ブロマイドは特別な処理、配送、廃棄要件と変異原2チアゾール オレンジはあまり変異原性 (3-4 x より Ames 試験で変異原性)3,4と一般との破棄できます一般的な化学廃棄物。
第二に、エチジウム ブロマイドは検出の紫外光を必要とします。チアゾール オレンジは紫外線必要に応じて、同様に使用することができますが、青色光とも検出することができます。紫外線は、一般的に使用されるいくつかの顕著な欠点を持っています。最初に、それは目や皮膚に有害です。紫外線は、訓練を受けた専門家によって安全に使用できる、偶発的な肌や目に害 (機能的日焼けに似て) 研究所 UV 光からは未熟な科学者は特に珍しいことではありません。第二に、紫外線は、DNA サンプル5(結紮変換など) 下流の実験1,6、7の成功を減らす非常に有害です。青い光で検出が可能に (λex、最大= 510 nm (488 nm、470 nm はまた強力な励起を示す))、皮膚の損傷は発生しませんまたは DNA 損傷 (ただし、任意の強烈な光は目に有害なあります)、両方科学者へのリスクが大幅に低減サンプル。
臭化エチジウム; にのみ蛍光色素の代替ではないです。その利点は、コストです。網状赤血球染色8、1980 年代に発見され、DNA ベースの蛍光実験9,10、11,12,13の数のユーティリティを発見しました。現在複数の仕入先によって販売しています。親化合物の追加より高価な青い光 – 検出可能な商業染料と検出1紫外線や青色光を用いた電気泳動の間に同様に動作します。さらに他の染料が汎用電気泳動実験の EtBr 以上に、非常に低い DNA 濃度により敏感になる中、このような染料は多くのコンテキストで価.
Protocol
Representative Results
Discussion
臭化エチジウムは長い知られている毒性にもかかわらず、分子生物学の実験室の標準的なツールをされています。それはまたそれが検出されて、DNA を損傷する UV ライトを要求する苦しみます。チアゾール オレンジ便利ですが高価な商業染料と同様、エチジウム ブロマイドに安価な代替を提供しています。
チアゾール オレンジの利点は、このように 2 倍です。まず、チ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はクリストファー ・ ニューポート大学から本校にスタートアップ資金によって支えられました。
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
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