Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering
Summary
Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.
Abstract
Afleidbare, weefsel-specifieke expressie is een belangrijk en krachtig hulpmiddel om te studeren de spatio-temporele dynamiek van genetische perturbation. De flexibele en efficiënte GreenGate klonen systeem met het bewezen en warempel LhGR systeem (hier genoemd GR-LhG4) voor de afleidbare expressie te combineren, hebben we gegenereerd een verzameling transgene Arabidopsis lijnen die de uitdrukking van een effector kan rijden cassette in een aantal specifieke celtypes in de drie belangrijkste plant meristems. Te dien einde, kozen we voor de eerder ontwikkelde GR-LhG4-systeem dat is gebaseerd op een chimeer transcriptiefactor en de promotor van een cognaat pOp-type zorgen voor een strakke controle over een breed scala van expressie niveaus. Bovendien, om te visualiseren het domein van de expressie waar de synthetische transcriptiefactor actief is, is een verslaggever ER-gelokaliseerde mTurquoise2 fluorescerende onder controle van de promoter pOp4 of pOp6 gecodeerd in stuurprogramma lijnen. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het genereren van een stuurprogramma of effector lijn en demonstreren hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Met behulp van meerdere of alle stuurprogramma lijnen, het specifieke effect van kader uiting te geven aan een of meerdere factoren (effectoren) onder controle van de promoter synthetische pOp kan worden beoordeeld snel, bijvoorbeeld in F1 planten van een kruising tussen een effector en meerdere stuurprogramma lijnen. Deze aanpak wordt geïllustreerd door de ectopische uitdrukking van VND7, een NAC transcriptiefactor staat inducerende ectopische cel van de secundaire muur depositie op autonome wijze van een cel.
Introduction
Een belangrijke beperking in de biologie in het postgenomic tijdperk is te ontcijferen van de specifieke rol van de context van een gegeven factor of genetische perturbation. Constitutieve genetische verstoringen zoals verlies-van- en winst-van-functie benaderingen vaak alleen toestaan eindpunt analyse van levenslang aanpassing processen, het onderscheid tussen primaire en secundaire effecten obfuscating. Daarnaast kunnen specifieke functies van de context worden gemaskeerd of verdund door grootschalige effecten in verre weefsels of tijdens de andere fasen van ontwikkeling. Bovendien, in extreme gevallen, kan letaliteit beletsel voor ieder mechanistische inzicht. Ideaal, om deze kwesties te omzeilen, kan een analyseren het effect van acute genetische perturbation binnen een specifieke context, zoals een specifieke celtype in een time-resolved wijze. Om dit te bereiken, zijn genetische hulpmiddelen voor afleidbare, cel type-specifieke expressie vereist1. Om een bron voor de snelle beoordeling van de spatio dynamiek van een reactie op een bepaalde effector, hebben wij gebundeld in het gemak van het klonen van de GreenGate systeem2 voorzien van de bewezen doeltreffendheid van de GR-LhG4 systeem3, 4,5,6. We hebben een verzameling lijnen uiten het chimeer transcriptiefactor dat lhg4 tot het ligand bindend domein van de rat corticoid receptor (GR)7 onder de controle van goed gekarakteriseerd cel type specifieke initiatiefnemers8 gesmoltengegenereerd. In rust voorwaarden, blijft de transcriptiefactor buiten de kern, zoals het domein GR is gebonden door de cytosolische HSP90. Met de toevoeging van synthetische ligand dexamethason (Dex), nucleaire translocatie wordt geïnduceerd en LhG4 zal bemiddelen transcriptie van expressie cassettes onder controle van de promotor van een cognaat synthetische pOp-type , zoals een mTurquoise2 verslaggever opgenomen in de regels van de bestuurder te visualiseren van het domein van de expressie na inductie. Dus, de bestuurder regels technisch bevatten ook een effector cassette. Het overschrijden van een verzameling stuurprogramma lijnen met een lijn met een effector cassette met, bijvoorbeeld, een gen van belang onder controle van de promoter pOp-type dezelfde dus laat de snelle beoordeling van de acute of langdurige gevolgen van effector expressie in een groot aantal celtypes.
Hier bieden we een protocol met een beschrijving van de procedures die noodzakelijk zijn voor het genereren van de bestuurder en effector lijnen en aantonen hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Om te illustreren de dapperheid en de specificiteit van deze aanpak, we gebruik maken van de bekende transcriptiefactor VND7 die in staat van rijden xylem-achtige secundaire cel muur heeft ectopically is9. Behandeling van de F1 van een kruising tussen de pSCR10,11 driver regel en de regel pOp6:VND7 effector leidt tot de vorming van ectopische xylem-achtige cellen in de schede van de zetmeel cellen van de Arabidopsis voortvloeien.
Ter vergemakkelijking van de generatie van grote verzamelingen van DNA nodig voor de bouw van de bestuurder en effector expressie plasmiden, gebruikten we de snelle en efficiënte GreenGate klonen van methode2. Het klonen van GreenGate is gebaseerd op de enzymen van de beperking van type II S zoals Eco31I of de isoschizomer Bsaik2. Deze enzymen knippen stroomafwaarts van hun sites van de asymmetrische erkenning overhangen met variërende basis samenstelling produceren. Door de integratie van Eco31I /Bsaik beperking sites in oligonucleotides en specifieke overstek sequenties aan DNA-elementen toe te wijzen, modulaire klonen is bereikt, het vergemakkelijken van het genereren van grote verzamelingen. In het kader van GreenGate vallen DNA modules in de categorieën A-F op basis van de volgorde van de overhang die dienen als adapters en worden geassembleerd in die volgorde. Daarom moet de inleidingen aan het versterken van uw gewenste product ontworpen overeenkomstig de geselecteerde module2 (figuur 1A). Als er een interne Eco31I is /Bsaik site en de volgorde is niet compatibel met de GreenGate ingang en bestemming modules, kunt u doorgaan zonder mutagenizing, maar met lagere efficiëntie. Als alternatief, plaats-geleide mutagenese kunt verwijderen Eco31I /Bsaik beperkingsplaatsen verzorgen als u niet wilt wijzigen van aminozuren in genproducten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het genereren en toepassen van een veelzijdige en uitgebreide toolkit voor afleidbare, cel type specifieke trans-activering. Overschrijding van lijnen uitvoering effector cassettes onder controle van de promoter pOp met stuurprogramma lijnen kunt deelneemt bestudeert de effecten van verkeerde expressie in de F1-generatie, de snelle beoordeling van genetische perturbation in een breed scala van celtypes inschakelen. U kunt ook effector constructies kunnen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk in onze laboratoria wordt ondersteund door de Duitse Research Foundation (DFG) subsidies WO 1660/6-1 (S.W.) en GR 2104/4-1 (T.G.) en SFB1101 (aan T.G. en J.U.L) en door een Europese Onderzoeksraad consolidator toekennen (PLANTSTEMS 647148) T.G. S.W. wordt ondersteund door de Emmy Noether Fellowship van de DFG door Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
