Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i Arabidopsis thaliana gjennom LhGR-mediert Trans-aktivisering
Summary
Her beskriver vi generering og søknad av en sette av transgene Arabidopsis thaliana linjer muliggjør induserbart, vev-spesifikke uttrykk i de tre viktigste meristems, skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium.
Abstract
Induserbart, vev-spesifikke uttrykk er en viktig og kraftig verktøy for å studere spatio-temporale dynamikken i genetisk forstyrrelsene. Kombinerer fleksibel og effektiv GreenGate kloning systemet med velprøvde og benchmarked LhGR system (her kalt GR-LhG4) for induserbart uttrykket, har vi generert et sett av transgene Arabidopsis linjer som kan kjøre uttrykk for en effektor kassett i en rekke spesifikke celletyper i de tre hoved plante meristems. Dette valgte vi tidligere utviklet GR-LhG4 systemet basert på en chimeric transkripsjon faktor og en beslektet type pOp promoter sikre stram kontroll over et bredt spekter av uttrykk. I tillegg for å visualisere uttrykk domenet der syntetiske transkripsjon faktoren er aktiv, er en ER lokalisert mTurquoise2 fluorescerende reporter under kontroll pOp4 eller pOp6 kodet i driveren linjer. Her beskriver vi nødvendig for å generere en driver eller effektor linje og demonstrere hvordan celle type spesifikke uttrykk kan indusert og fulgte i skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium av Arabidopsis. Ved hjelp av flere eller alle linjer, kontekst spesifikk effekten av uttrykke en eller flere faktorer (effektor) under kontroll syntetiske pOp kan vurderes raskt, for eksempel i F1 planter en mellomting mellom en effektor og flere driveren linjer. Denne tilnærmingen er eksemplifisert ved ektopisk uttrykk for VND7, en NAC transkripsjon faktor kan indusere ektopisk videregående cellen vegg avsettelse i en celle autonom måte.
Introduction
En stor begrensning i biologi i postgenomic tid er å dechiffrere rollen sammenheng spesifikke for en bestemt faktor eller genetisk forstyrrelsene. Konstituerende genetisk forstyrrelser som tap-av-funksjon og gevinst-av-funksjon tilnærminger ofte bare tillate end-point analyse av livslang tilpasning prosesser, obfuscating skillet mellom primær og sekundær effekter. I tillegg kan sammenheng bestemte funksjoner, maskert eller utvannet av storskala effekter i fjerne vev eller andre faser av utviklingen. Videre, i ekstreme tilfeller, dødelighet kan utelukke noen mekanistisk innsikt. For å omgå disse problemene, kan en ideal, analysere effekten av akutt genetisk forstyrrelsene i en bestemt kontekst som en bestemt celle type på en gang-løst måte. For å oppnå dette, er genetisk verktøy for induserbart, celle type-spesifikk uttrykk nødvendig1. Hvis du vil gi en ressurs for rask vurdering av spatiotemporal dynamikken i et svar på en gitt effektor, har vi kombinert enkel kloning levert av GreenGate system2 med bevist effekten av GR-LhG4 systemet3, 4,5,6. Vi har generert et sett med linjer uttrykke chimeric transkripsjon faktoren LhG4 smeltet ligand binding domenet av rotte corticoid reseptor (GR)7 under kontroll av godt karakterisert celle type bestemte arrangørene8. I hvile forhold, fortsatt transkripsjon faktor utenfor kjernen, GR domenet er bundet av cytosolic HSP90. Med tillegg av syntetiske ligand deksametason (Dex), kjernefysiske translokasjon er indusert og LhG4 vil formidle transkripsjon av uttrykket kassetter under kontroll av en beslektet syntetiske type pOp promoter, som en mTurquoise2 reporter inkludert i driveren linjene visualisere uttrykk domenet etter innledningen. Dermed driveren linjene teknisk inneholder også en effektor kassett. Krysset av driveren linjer med en linje som bærer en effektor kassett med, for eksempel en genet av interesse under kontroll samme type pOp dermed lar rask vurdering av akutt eller langsiktige konsekvensene av effektor uttrykk i en rekke celletyper.
Her gir vi en protokoll som beskriver prosedyrene generere driveren og effektor linjene og demonstrere hvordan celle type spesifikke uttrykk kan indusert og fulgte i skyte apikal meristem, rot apikal meristem og cambium av Arabidopsis. For å illustrere dyktighet og spesifisitet av denne tilnærmingen, vi utnytter den velkjente transkripsjon faktoren VND7 som kan kjøre vedvev-lignende videregående cellen vegg thickenings ectopically9. Behandle F1 fra et kryss mellom pSCR10,11 driver linjen og pOp6:VND7 effektor linje fører til dannelse av ektopisk vedvev som celler i stivelse skjede celler av Arabidopsis stem.
For å lette generasjonen av store DNA samlinger kreves for å konstruere driveren og effektor uttrykk plasmider, brukte vi den rask og effektiv GreenGate kloning metode2. GreenGate kloning er basert på type II S begrensning enzymer som Eco31I eller dens isoschizomer Bsajeg2. Disse enzymene kuttet nedstrøms asymmetrisk anerkjennelse områdene produsere overheng med varierende base sammensetning. Ved å innlemme Eco31I /Bsajeg begrensning nettsteder i oligonucleotides og tildele bestemte overheng sekvenser til DNA elementer, modulære kloning er oppnådd, tilrettelegge generering av store samlinger. I GreenGate rammen faller DNA moduler i kategorier A-F basert på overheng sekvens som fungerer som kort og er samlet i den rekkefølgen. Derfor bør primerne utviklet for å forsterke din ønsket produkt være i henhold til den valgte modul2 (figur 1A). Hvis det er en intern Eco31I /Bsajeg området og rekkefølgen er ikke kompatibel med GreenGate oppføringen og destinasjon moduler, kan du fortsette uten mutagenizing, men med lavere effektivitet. Også bruke nettstedet-rettet mutagenese fjerne Eco31I /Bsajeg begrensning nettsteder ta vare ikke for å endre aminosyrer i genet produkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi nødvendig for å generere og bruke en allsidig og omfattende verktøykasse for induserbart, celle type bestemt trans-aktivisering. Krysset linjer bærer effektor kassetter under kontroll pOp med driveren linjer kan studere mis uttrykk effektene i F1 generasjon, slik at rask vurdering av genetisk forstyrrelsene i en rekke celletyper. Alternativt effektor konstruksjonene kan brukes til å transformere driveren linjer eller ved å tilpasse kloning strategi, fører og effektor konstruere k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeid i våre laboratorier støttes av tysk Research Foundation (DFG) tilskudd WO 1660/6-1 (til S.W.) og GR 2104/4-1 (til TG) og SFB1101 (til TG og J.U.L) og en europeisk forskningsråd consolidator gir (PLANTSTEMS 647148) til TG S.W. støttes gjennom Emmy Noether fellesskap av DFG gjennom Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
