Inducerade, Cell typspecifika uttryck i Arabidopsis thaliana genom LhGR-medierad Trans-aktivering
Summary
Här beskriver vi generationen och tillämpning av en uppsättning transgena Arabidopsis thaliana linjer möjliggörande inducerbara, vävnadsspecifika uttryck i de tre huvudsakliga meristems, av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och Kambium.
Abstract
Inducerbara, vävnadsspecifika uttryck är ett viktigt och kraftfullt verktyg för att undersöka genetisk störning plats och tid dynamik. Kombinera den flexibla och effektiva GreenGate kloning system med beprövade och benchmarking LhGR systemet (här kallas GR-LhG4) för inducerbara uttrycket, har vi genererat en uppsättning transgena Arabidopsis linjer som kan köra uttrycket av en effektor kassett i en rad specifika celltyper i de tre viktigaste växt meristems. Därför valde vi i tidigare utvecklade GR-LhG4 system baserat på en chimär transkriptionsfaktor och cognate pOp-typ förespråkare att säkerställa tight kontroll över ett brett spektrum av uttryck nivåer. Dessutom för att visualisera uttryck domänen där den syntetiska transkriptionsfaktor är aktiv, är en ER-lokaliserad mTurquoise2 fluorescerande reporter under kontroll av promotorn pOp4 eller pOp6 kodad i drivrutinen linjer. Här, beskriver vi stegen som krävs för att generera en drivrutin eller effektor linje och demonstrera hur cellen typ uttryck kan inducerad och följt av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och cambium av Arabidopsis. Med hjälp av flera eller alla förare linjer, sammanhang effekten att uttrycka en eller flera faktorer (effektorer) under kontroll av syntetiska pOp arrangören kan bedömas snabbt, till exempel i F1 växter av en korsning mellan en effektor och flera drivrutinen linjer. Detta tillvägagångssätt exemplifieras av ektopisk uttryck för VND7, en NAC transkriptionsfaktor kan framkalla ektopisk sekundär cell wall nedfall i en cell självständigt sätt.
Introduction
En stor begränsning i biologi i den postgenomic eran är att dechiffrera sammanhang specifika roll en given faktor eller genetisk störning. Konstituerande genetiska störningar såsom förlust-av-funktion och gain-of-function strategier ofta endast tillåta slutpunkten analys av livslångt anpassning processer, fördunklar distinktionen mellan primära och sekundära effekter. Dessutom kan sammanhang specifika funktioner maskeras eller utspädd av storskaliga effekter i avlägsna vävnader eller under övriga faser av utveckling. Dessutom i extrema fall, kan dödlighet hindra någon mekanistisk insikt. Idealiskt, för att kringgå dessa frågor, kan man analysera effekten av akut genetisk störning inom ett visst sammanhang såsom en viss celltyp i en tid-löst sätt. För att uppnå detta, är genetiska verktyg för inducerbara, cell typspecifika uttryck krävs1. För att ge en resurs för snabb bedömning av spatiotemporal dynamiken i ett svar på en viss effektor, har vi kombinerat lättheten av kloning som tillhandahålls av GreenGate system2 med beprövade effekten av GR-LhG4 system3, 4,5,6. Vi har skapat en uppsättning rader som uttrycker den chimära Transkriptionfaktorn LhG4 smält till ligand bindande domänen av råtta kortikoid receptor (GR)7 under kontroll av välkarakteriserad cell typ specifika initiativtagare8. I vilande tillstånd, förblir transkriptionsfaktor utanför cellkärnan, som GR domänen är bunden av den cytosoliska HSP90. Med tillägg av syntetiska ligand dexametason (Dex), translokationen i cellkärnan induceras och LhG4 kommer att medla transkription av uttrycket kassetter under kontroll av ett cognate syntetiska pOp-typ Promotorn, såsom en mTurquoise2 reporter ingår i raderna föraren att visualisera domänen uttryck efter induktion. Således driver raderna tekniskt innehåller också en effektor-kassett. Passage av en uppsättning driver linjerna med en linje som bära en effektor kassett med, till exempel en gen av intresse under samma pOp-typ Promotorns kontroll således tillåter snabb bedömning av de akuta eller långsiktiga konsekvenserna av effektor uttryck i en mängd olika celltyper.
Här, tillhandahåller vi ett protokoll som beskriver förfarandena som är nödvändiga att generera raderna drivrutin och effektor och demonstrera hur cellen typ uttryck kan inducerad och följt av skjuta apical meristem, av roten apical meristem och cambium av Arabidopsis. För att illustrera den skicklighet och specificitet av denna strategi, vi använder den välkända transkriptionsfaktor VND7 som kan köra xylem-liknande sekundär cell wall thickenings ectopically9. Behandling av F1 från en korsning mellan pSCR10,11 driver linjen och pOp6:VND7 effektor linjen leder till bildandet av ektopisk xylem-liknande celler i stärkelse skidan celler av de Arabidopsis stam.
Om du vill underlätta genereringen av stora DNA-sammansättningar som krävs för att konstruera drivrutin och effektor uttryck plasmider, använde vi den snabbt och effektivt GreenGate kloning metod2. GreenGate kloning är baserat på typ II S restriktionsenzym såsom Eco31I eller dess isoschizomer BsaI2. Dessa enzymer skära downstream av deras asymmetriska erkännande webbplatser producerar överhäng med varierande bas sammansättning. Genom att införliva Eco31I /Bsajag begränsning platser i oligonukleotider och att tilldela specifika överhäng sekvenser till DNA-element, modulära kloning uppnås, att underlätta genereringen av stora sammanställningar. Inom ramen för GreenGate faller DNA moduler kategorier A-F baserat på överhäng sekvens som fungera som adaptrar och är monterade i den ordningen. Primers för att förstärka din önskade produkt bör därför enligt vald modul i2 (figur 1A). Om det finns en inre Eco31I /Bsajag webbplats och sekvensen är inte kompatibel med modulerna GreenGate inträde och destination, kan du gå vidare utan mutagenizing, men med lägre effektivitet. Alternativt använda webbplats riktad mutagenes ta bort Eco31I /Bsajag begränsning platser utan för att ändra aminosyror i genprodukter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, vi beskriver stegen för att skapa och tillämpa en mångsidig och omfattande verktygslåda för inducerbara, cell typ specifika trans-aktivering. Passerar linjer som transporterar effektor kassetter under kontroll av promotorn pOp med drivrutinen linjer kan studera mis uttryck effekter i F1-generationen, möjliggör en snabb bedömning av genetisk störning i en rad olika celltyper. Alternativt, effektor konstruktioner kan användas för att omvandla driver linjer eller genom att anpassa kloning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbete i våra laboratorier stöds av tyska Research Foundation (DFG) bidrag WO 1660/6-1 (till S.V.) och GR 2104/4-1 (till T.G.) och SFB1101 (till T.G. och J.U.L) och av ett europeiskt forskningsråd consolidator bevilja (PLANTSTEMS 647148) till T.G. S.V. stöds genom Emmy Noether gemenskap av DFGEN genom Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
