Denne protokol beskriver generation af blandet murine knoglemarv kimærer med spontane autoimmune Kimcentre, i hvilke autoreactive lymfocytter bære en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (PA-NGL) reporter. Dette giver mulighed for at samkøre cellular placering i væv med downstream molekylære og funktionelle analyser.
Autoimmune sygdomme udgør en betydelig sundhedsbyrde. Grundlæggende spørgsmål vedrørende udvikling og progression af autoimmun sygdom forblive ubesvarede. En forudsætning for fremskridt i vores forståelse af de underliggende sygdomsmekanismer og cellulære dynamics er den præcise kobling af microanatomical placeringen af celle subsets med downstream molekylære eller funktionelle analyser; et mål, der traditionelt har været vanskeligt at opnå. Udviklingen af stabile photoactivatable biologiske fluorophores og deres integration i reporter stammer har for nylig aktiveret præcise microanatomical mærkning og sporing af cellulære delmængder i murine modeller. Her, beskriver vi hvordan evnen til at analysere autoreactive lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan bidrage til at give ny indsigt i autoimmunitet, ved hjælp af en kombination af en roman kimære model af autoimmunitet med en photoactivatable journalist som eksempel . Vi demonstrere en procedure til at generere blandet kimærer med spontane autoreactive Kimcentre befolket af lymfocytter bærer en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner reporter. Brug in vivo mærkning strategier, kan enkelt Kimcentre visualiseres i eksplanterede lymfoide væv og deres cellebestanddele photoactivated af to-foton mikroskopi. Photoactivated lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan derefter analyseres eller sorteret flow cytometrically, som enkelt celler eller i bulk, og kan blive udsat for yderligere downstream molekylære og funktionelle analyser. Denne tilgang kan direkte anvendes til at give fornyet indsigt inden for autoimmunitet, men proceduren for generering af knoglemarven kimærer og photoactivation procedure kan desuden finde bred anvendelse i undersøgelser af smitsomme sygdomme og tumor metastaser.
Forekomsten af autoimmune sygdom er steget hurtigt i de seneste årtier, især i de vestlige samfund. Dag, autoimmun sygdom rangerer tredje på listen over mest udbredte årsager til sygelighed og dødelighed i den vestlige verden1. Grundlæggende spørgsmål vedrørende udvikling og progression af autoimmun sygdom forblive ubesvarede. En forudsætning for fremskridt i vores forståelse af de underliggende sygdomsmekanismer og cellulære dynamics er den præcise kobling af celle subsets med downstream molekylære eller funktionelle analyser microanatomical placering. I det seneste årti har har udviklingen af et antal af stabile photoconvertible, photoactivatable eller photoswitchable biologiske fluorophores og deres integration i reporter stammer aktiveret den præcise microanatomical mærkning og sporing af cellulære delgrupper i murine modeller.
Kaede, en photoconvertible fluorescerende proteiner med oprindelse fra en stony koral, gennemgår irreversibel photoconversion fra grønne fluorescens til røde fluorescens ved udsættelse for violet eller ultraviolet lys2. I første omgang ansat til at følge den dynamiske opførsel af individuelle celler i at udvikle organotypic hjerne skiver3, blev generation af en Kaede knock-i mus efterfølgende tilladt overvågning cellulær bevægelse in vivo, og systemet anvendt til analyser af immun celle migration til og fra lymfeknuder4. Denne tilgang blev efterfølgende raffineret med en anden generation reporter5. En lignende reporter er Dendra6, som for nylig blev brugt til at spore lymfeknude metastaser i vivo7.
Den første photoactivatable protein udviklet var en grøn fluorescerende proteiner (NGL) konstrueret med et enkelt punkt mutation (T203H), fører til en meget lav absorbans i regionen bølgelængde fra 450-550 nm8. Efter photoactivation af ultraviolet lys, denne photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (PA-NGL) skifter absorption maximum fra ~ 400 til ~ 500 nm, giver et omtrentlige 100-fold intensiteten stiger, når ophidset med en bølgelængde på 488 nm. Generation af Transgene mus, hvor alle hæmatopoietisk celler express PA-normal god landbrugspraksis tilladt for første gang dybtgående analyser af B-celle udvalg i anatomisk defineret lyse og mørke zoner af germinal center9.
Photoactivation er en irreversibel omdannelse fra en ikke-fluorescerende stat til en fluorescerende tilstand, og photoconversion er en en-vejs overgang fra én bølgelængde til en anden, er photoswitchable proteiner købedygtig shuttle mellem begge betingelser10 . Denne sidstnævnte kapacitet blev for nylig udnyttes til at ingeniør optisk kontrol af protein aktivitet11.
Udnytte PA-normal god landbrugspraksis reporter, præget vi for nylig B celle repertoirer af enkelt Kimcentre i en roman model af spontan lupus-lignende autoimmunitet12. Denne model er baseret på blandede kimærer med 1 del knoglemarv husly en autoreactive B-celle receptoren knock-i med specificitet for ribonuclear-protein komplekser (564Igi13,14) kombineret med 2 dele knoglemarv fra alle ønskede donor. På ca 6 uger post rekonstitution, er homeostatiske betingelser opnået, hvilke spontane autoreactive Kimcentre er til stede i milten og de kutane lymfeknuder. Især, den germinal center B-celle population er næsten udelukkende (~ 95%) sammensat af celler, der stammer fra ikke-564Igi rum, og disse wild-type-afledte B-celler er blevet autoreactive. Derfor, modellen tillader ‘plug-and-play’ tilgang til analyser af autoreactive germinal center B-celler ved hjælp af forskellige transgener, knock-outs og journalister. Her, beskrive vi proceduren for at skabe blandede kimærer med spontane autoreactive Kimcentre befolket af lymfocytter transporterer PA-normal god landbrugspraksis reporter. Brug in vivo mærkning strategier, kan enkelt Kimcentre visualiseres i eksplanterede lymfoide væv og deres cellebestanddele photoactivated ved hjælp af en to-foton mikroskop. Photoactivated lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan efterfølgende analyseret ved flowcytometri eller sorteret efter fluorokrom-aktiveret celle sortering (FACS) og underkastes supplerende downstream molekylære og funktionelle analyser. Evnen til at analysere autoreactive lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan direkte anvendes til at give fornyet indsigt inden for autoimmunitet, men de teknikker og metoder beskrevet kan desuden finde relevante applikationer i undersøgelser af smitsomme sygdomme og tumor metastaser.
Et stort antal murine modeller af autoimmunitet er tilgængelige, hvoraf mange er til stede med spontane Kimcentre16. Men mange af de tilgængelige modeller harbor komplekse genetiske baggrunde eller mutationer i centrale regulatorer af lymfocyt spredning eller aktivering, gør dem dårligt egnet til intercrossing med journalisten linjer og studier af normale lymfocyt adfærd i autoimmunitet, henholdsvis. Den nuværende model, tværtimod tillader ‘plug-and-play’ tilgang til dybdegående analyser af autoreactive wild-type-afledte germinal center B celler ved hjælp af enhver ønsket kombination af transgener, knock-outs og journalister, i det foreliggende tilfælde repræsenteret af photoactivatable normal god landbrugspraksis. Brug in vivo mærkning strategier, kan enkelt Kimcentre visualiseres i eksplanterede lymfoide væv og deres cellebestanddele photoactivated ved hjælp af en to-foton mikroskop. Photoactivated lymfocytter fra enkelt Kimcentre kan derefter blive analyseret eller sorterede flow cytometrically, som enkelt celler eller i bulk. Disse celler kan efterfølgende blive udsat for yderligere downstream molekylære og funktionelle analyser at give fornyet indsigt inden for autoimmunitet.
Der er nogle vigtige trin til vellykket præstation af denne procedure. Som det fremgår af de repræsentative resultater, bestråling (1.100 Rad) og donor knoglemarv rekonstituering med succes erstatte den modtagende knoglemarv rum giver næsten fuldstændig kimærisme i B-celle rum. Dette er et vigtigt punkt, som resterende modtageren-afledte B celler ville gøre et undersæt af befolkningens germinal center ‘mørk’. Uanset kilden til bestråling, har dosis/timing af bestråling skal optimeres for at giver maksimal myeloablative effekt med minimal sikkerhedsstillelse vævsskader til dyrene. Til rekonstitution, er knogle-crush protokol og rekonstituering med 20 millioner samlede donor celler blevet fundet at håndfast give høj rekonstitution grader. Arbejder steril og kold/på is til knoglemarven udvinding sikrer høj rentabilitet af donor marv. For at nå den ønskede donor knoglemarv nøgletal, er det nødvendigt at udvise stor omhu ved optælling delprøver af celler, både for at tælle sig selv, og når du tager ud delprøve af knoglemarv til optælling. Blanding og co pelleringsmidler donor courgetter, i stedet for centrifugering og resuspending separat og derefter blande, tjener til at forhindre enhver skævhed i donor nøgletal efter celle optællingen.
Blandet knoglemarv chimera generation af protokollen kan stå alene, og det giver generation af kimærer med autoreactive Kimcentre ønskede reporter, transgene og knock-out. Dog er en begrænsning til dette behovet for at bruge histocompatible donorer. 564Igi stamme er på en C57Bl/6J congenic baggrund, og som en konsekvens af andre donor(s) og modtagerne skal have en H-2b congenic baggrund (eller alternativt, 564Igi stammen bør være backcrossed til den ønskede stamme og autoimmune fænotype kontrolleret på den nye baggrund). Proceduren for bestråling tendens til at favorisere en tolerogenic miljø17, og uoverensstemmelser i nogle mindre histocompatibility antigener kan tolereres. Dog, dette aspekt bør grundigt overvejes, især hvis blanding mandlige og kvindelige donorer og/eller modtagerne, på grund af potentialet for kvindelige reaktivitet med mand-begrænset Y-antigener.
På samme måde, photoactivation aspekt i protokollen kan stå alene, og kan bruges i mange forskellige sammenhænge. PA-normal god landbrugspraksis reporter er imidlertid i øjeblikket kun tilgængelig med UBC promotor, der er aktive i alle hæmatopoietisk slægt celler, men ikke i stromale celler. Som nævnt i indledningen, andre photoactivatable, photoswitchable eller photoconvertible reporter stammer er tilgængelige, og PA-normal god landbrugspraksis, kan erstattes med passende justering af forsøgsbetingelser.
Det er vigtigt at undgå utilsigtet photoactivation af uønskede områder, ved at fastholde laser godt over 900 nm når imaging, som denne bølgelængde vil ikke photoactivate PA-normal god landbrugspraksis. For photoactivation, sig selv, specifikke indstillinger, såsom laser power og pixel hviletid, vil afhænge af dybden i vævet, den specifikke væv bruges og billedbehandling system, og hver applikation har til at være optimeret til det specifikke imaging system anvendes. Pleje skal tages ikke til solskader cellerne, men det er samtidig vigtigt at få effektive photoactivation i hele stakken, for at få en tilstrækkelig repræsentation aktiveret celleområde downstream analyser. Germinal center B celler generelt udgør overalt fra 0,5% til ~ 2% af milt eller kutan lymfeknude B celler, og som kan ses fra de repræsentative resultater (figur 5), photoactivated enkelt germinal center B celler kan fyldes op ~ 1% af samlet bestand, der findes i en enkelt milt skive. Vellykket analyse eller sortering af et betydeligt antal celler kræver derfor, behandling af en lang række begivenheder.
The authors have nothing to disclose.
SE Degn er en Lundbeckfonden fyr og en Carlsberg Foundation fornem fyr. Dette arbejde var delvis desuden støttet af en NNF biomedicinsk Grant (SE Degn).
Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | – | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | – | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
PBS | Sigma | d8537 | |
Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91197-00 | |
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST – Fine Science Tools | 91460-11 | |
Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |