Forhøre personlige Autoreactive Germinal sentre av Photoactivation i en blandet Chimeric modell av autoimmunitet

Summary

Denne protokollen beskriver generasjonen av blandet murine benmarg chimeras med spontan autoimmune germinal sentre, i hvilken autoreactive lymfocytter bærer photoactivatable grønne fluorescerende protein (PA-GFP) reporter. Dette gir muligheten til å koble mobilnettet plassering i vev med nedstrøms molekylære og funksjonelle analyser.

Abstract

Autoimmune sykdommer presentere en betydelig helse byrde. Grunnleggende spørsmål om utvikling og progresjon av autoimmune sykdommer forblir ubesvart. En forutsetning for fremskritt i vår forståelse av underliggende sykdom mekanismer og mobilnettet dynamics er presis koblingen av microanatomical plasseringen av celle undergrupper med nedstrøms molekylære eller funksjonelle analyser; et mål som har tradisjonelt vært vanskelig å oppnå. Utvikling av stabile photoactivatable biologiske fluorophores og deres integrering i reporter stammer har nylig aktivert presis microanatomical merking og sporing av mobilnettet delsett i murine modeller. Her beskriver vi hvordan muligheten til å analysere autoreactive lymfocytter fra enkelt germinal sentre kan bidra til å gi ny innsikt i autoimmunitet, med kombinasjonen av en roman chimeric modell av autoimmunitet photoactivatable reporter som et eksempel . Vi viser en prosedyre for å generere blandet chimeras med spontan autoreactive germinal sentre befolket av lymfocytter bærer photoactivatable grønne fluorescerende protein reporter. Bruker i vivo merking strategier, kan enkelt germinal sentre visualiseres i explanted lymfoid vev og deres mobilnettet bestanddeler photoactivated to-fotonet mikroskopi. Photoactivated lymfocytter fra enkelt germinal sentre kan deretter analyseres eller sortert flyt cytometrically, som enkeltceller eller samtidig, og kan bli utsatt for flere nedstrøms molekylære og funksjonelle analyser. Denne tilnærmingen kan direkte brukes til å gi fornyet innsikt i feltet av autoimmunitet, men fremgangsmåten for å generere benmarg chimeras og photoactivation fremgangsmåten finner i tillegg bred anvendelse i studier av infeksjonssykdommer og svulst metastaser.

Introduction

Forekomsten av autoimmune sykdommer har økt raskt i de siste tiårene, spesielt i vestlige samfunn. I dag, autoimmune sykdommer ranks tredje på listen over mest utbredte årsakene til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden¹. Grunnleggende spørsmål om utvikling og progresjon av autoimmune sykdommer forblir ubesvart. En forutsetning for fremskritt i vår forståelse av underliggende sykdom mekanismer og mobilnettet dynamics er presis koblingen av microanatomical plasseringen av celle undergrupper med nedstrøms molekylære eller funksjonelle analyser. I det siste tiåret, har utviklingen av en rekke stabil photoconvertible, photoactivatable eller photoswitchable biologiske fluorophores og deres integrering i reporter stammer aktivert den presise microanatomical merking og sporing av mobilnettet delsett i murine modeller.

Kaede, en photoconvertible fluorescerende protein fra en steinete korallrev, gjennomgår irreversibel photoconversion fra grønne fluorescens til rød fluorescens ved eksponering til fiolett eller ultrafiolett lys². Først ansatt å følge den dynamiske oppførselen til enkeltceller i å utvikle organotypic hjernen skiver³, ble generasjon av en Kaede bank i musen senere tillatt overvåking mobilnettet bevegelse i vivo, og systemet brukt på analyser av immun celle migrasjon til og fra lymfeknuter⁴. Denne tilnærmingen ble senere forbedret med en ny generasjon reporter⁵. En lignende reporter er Dendra⁶, som nylig ble brukt til å spore lymfeknute metastaser i vivo⁷.

Første photoactivatable protein utviklet var en grønn fluorescerende protein (GFP) konstruert med en enkelt punkt mutasjon (T203H), fører til en svært lav absorbansen i bølgelengdeområdet fra 450 til 550 nm⁸. Etter photoactivation av fiolett lys, dette photoactivatable grønne fluorescerende protein (PA-GFP) slår maksimumsnivå absorpsjon ~ 400-~ 500 nm, gir en omtrentlig 100-fold intensitet øke når opphisset med en bølgelengde på 488 nm. Generering av transgene mus som alle blodkreft celler uttrykke PA-GFP lov, for første gang, Dyptgående analyser av B celle utvalg i anatomisk definerte lyse og mørke soner av germinal sentrum⁹.

Mens photoactivation er en irreversibel konverteringen fra en ikke-fluorescerende tilstand til en fluorescerende tilstand, og photoconversion er en enveis overgang fra en bølgelengde til en annen, er photoswitchable proteiner kjøpedyktig mellom begge betingelsene¹⁰ . Denne sistnevnte kapasiteten ble nylig brukt til å ingeniør optisk kontroll av protein aktivitet¹¹.

Utnytte PA-GFP reporter, preget vi nylig av B celle repertoar av enkelt germinal sentre i en ny modell av spontane lupus-lignende autoimmunitet¹². Denne modellen er basert på blandet chimeras med 1 del benmarg skjuler en autoreactive B celle reseptor banke på med spesifisitet for ribonuclear-protein komplekser (564Igi^13,14) kombinert med 2 deler benmarg fra noen ønsket donor. På ca 6 uker innlegg rekonstituering, er homøostatisk betingelsene oppnådd i som spontan autoreactive germinal sentre er tilstede i milten og lymfeknutene kutan. Spesielt germinal sentrum B-celle befolkningen er nesten utelukkende (~ 95%) består av cellene stammer fra ikke-564Igi rommet, og disse vill-type-avledet B celler har blitt autoreactive. Derfor tillater modellen en “plug-and-play”-tilnærming til analyser av autoreactive germinal sentrum B celler ved hjelp av ulike effekter av transgener, knock-outs og journalister. Her beskriver vi fremgangsmåten for å generere blandet chimeras med spontan autoreactive germinal sentre befolket av lymfocytter bærer PA-GFP reporter. Bruker i vivo merking strategier, kan enkelt germinal sentre visualiseres i explanted lymfoid vev og deres mobilnettet bestanddeler photoactivated bruker en to-fotonet mikroskop. Photoactivated lymfocytter fra enkelt germinal sentre kan deretter analysert av flowcytometri eller sortert etter fluorochrome-aktivert celle sortering (FACS) og utsatt for flere nedstrøms molekylære og funksjonelle analyser. Muligheten til å analysere autoreactive lymfocytter fra enkelt germinal sentre kan direkte brukes til å gi fornyet innsikt i feltet av autoimmunitet, men teknikker og tilnærminger beskrevet kan i tillegg finne relevante programmer i studier av smittsomme sykdommer og svulst metastaser.

Protocol

Alle dyr bruk likedannet EU retningslinjene og ble godkjent av danske dyr forskning Inspectorate (2017-15-0201-01348). 1. generell musen rettsgrunnlag og utarbeidelse av buffere og verktøy House mouse linjer under bestemte patogen gratis (SPF) forhold, med periodiske overvåking av helsetilstanden i henhold til standard retningslinjer. Valgfritt: Kontroller fravær av spontane germinal sentre i naiv mus skyldes ikke overvåkes adventivskudd infeksjoner. Dette kan gjøres enten ved immunofluorescence mikroskopi (tilstedeværelsen av germinal sentrum strukturer) eller flow cytometri (frekvens germinal sentrum B celler) som beskrevet tidligere12.Merk: Enten kvinner eller menn kan brukes. Vanligvis er det ideelle sex kamp givere og mottakere, som mellom sex kan teoretisk sett føre til alloreactivity mot mannlige Y-antigen av kvinnelige mottakere/givere15. Bruk CD45.1 mottakere (B6. SJL -Ptprcen Pepcb/BoyJ) rundt 6-10 uker gamle. Bruk 564Igi (B6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) og PA-GFP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) givere for 6-12 ukens av alderen. Sterilisere kirurgiske verktøy (rett fine saks og Dumont tang #5 og #7) av autoklavering dem ifølge rutinemessig sterilisering retningslinjer. Forberede 500 mL benmargen (BM) bufferen som inneholder fosfat-bufret saltvann (PBS), 2% fosterets Bovine Serum (FBS), 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) ved pH 7.4. For å forberede BM buffer, legge 10 mL inaktivert (1 time i et 56 ° C vannbad å deaktivere komplement) FBS og 1,25 mL av en 400 mM EDTA løsning (justert til pH 7.4) til 500 mL PBS, pH 7.4 og bland godt. Filtrere bufferen med en 0,2 µm filter kolbe. Klargjør 10 mL av røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) ved å fortynne 1 mL av en 10 x aksje å 10 mL av totalt volum med reagens klasse vann. Forberede 50 mL av PBS med 5 mM EDTA, pH 7.4. 2. opprettelsen av blandet benmarg chimeras Bestråling av mottakere (dag 0) Plasser CD45.1 benmarg mottakerne i en passende bestråling beholder og irradiate med 1100 Rad i en gamma-irradiator.Merk: Alternative bestråling kilder kan brukes. Uavhengig av kilden må dose/tidspunktet være optimalisert for å gi maksimal myeloablative effekt med minimal sivile vevsskade dyrene. Plass på antibiotika vann ad lib (1 mg av sulfadiazin og 0,2 mg trimethoprim/mL drikkevann). Utvinning av bein (dag 1) Bedøve 564Igi benmarg givere av kontinuerlig strøm av 4% isoflurane i luften, og euthanize av cervical forvridning. Spray ned givere med etanol og plassere dem på sterilt kirurgisk pads i flyt panseret. Fortsett å arbeide opprettholde sterile forhold, sterile buffere og utstyr. Til ekstrakt femur og tibia, først gjør en snitt rundt ankelen og utvide oppover til hoften med rett fine saks. Bruker en kraftig tang eller tommelen og indeksen fingrene, trekke huden opp og ut beinet mot kroppen. Tilsvarende trekke huden ned og foten. Pop ut kne og ankel leddene ved å flytte skaftet hoften og trekke foten kraftig. Fortsette å bryte ankelen felles og trekke foten mot kroppen mens du holder å tibia, dermed stripping senene og musklene av tibia. Bryte kneet felles å løslate tibia, og tilsvarende trekke dette mot kroppen mens du holder til femur, dermed stripping sener og muskler av femur. Foreta et snitt på hofteleddet kuttet sener, og trekke femur ut fra hip-kontakten. Gjenta trinn 2.2.2-2.2.4 for kontralateral side. Rengjør bein nøye ved å gni dem med en grov tørkepapir for å fjerne alle gjenværende muskler og bindevev. Deretter skylle dem i iskalde BM buffer før endelig overfører dem til frisk kaldt BM bufferen på is med en Dumont #7 tang. Gjenta trinn 2.2 for PA-GFP givere.Merk: Antall bein margtransplantasjon celler fra en enkelt donor varierer etter kjønn og alder. Skalere giverne ønskede input benmarg prosenter og tall og ønsket antall mottakere. Hvis givere er knappe, kan foran beina inkluderes for benmarg utvinning. Dette gir vanligvis et ekstra 1/3 til ½ cellene fra bakbeina. Vanligvis kan hvor som helst fra 50-200 millioner celler gjenopprettes per donor, avhengig av alder, kjønn, bakgrunn og om bare hind eller både hind og foran lemmer er inkludert. Benmarg celle utvinning Klargjør mørtelen ved skylling iskald BM buffer. Avløp skyll bufferen og bruker en elektrisk pipette-kontroller med en 10 mL serologisk pipette til 10 mL av fersk iskald BM buffer. Overføre bein fra 564Igi givere til mørtelen med en Dumont #7 tang og bruke støter å knuse og male bein å løslate benmargen. Sug opp benmarg utdrag med en 10 mL serologisk pipette og passere gjennom en 70 µm celle sil i en 50 mL tube på is. Legge til en ekstra 10 mL av fersk iskald BM buffer mørtelen Gjenta for å sikre fullstendig gjenoppretting av celler. Fjerne bein materiale fra mørtelen med et papirhåndkle, forkaste hensiktsmessig og skyll mørtelen med 70% etanol, etterfulgt av BM buffer. Gjenta trinn 2.3 for gruppen PA-GFP benmarg donor. Telle bein margtransplantasjon celler Bruker brønnene, plass en dråpe som inneholder 40 µL av RBC lyseringsbuffer på et stykke plast parafin film. Inverter 564Igi benmarg røret et par ganger og ta ut en 10 µL aliquot ved hjelp av brønnene. Bland det med den 40 µL av RBC lysis buffer drop. Senere legger til 50 µL av Trypan blå (0,4% vannoppløsning) i rullegardinmenyen. Umiddelbart laste 10 µL av den resulterende blandingen i en Burker-Turk hemocytometer og antall under mikroskopet. Beregne antall celler per mL, bruker 10 x totale fortynningsfaktoren. Bekrefte tilstrekkelig celle levedyktighet > 90%. Gjenta trinn 2.4 for gruppen PA-GFP benmarg donor. Forbereder donor suspensjoner Basert på teller innhentet i trinn 2.4 og ønsket antall mottakere, beregne volumet av donor benmarg fra hver av de to donor skal blandes i donor blanding røret.Merk: For eksempel for å konfigurere en gruppe 1:2 blandet 564Igi:PA-GFP chimeras med 6 CD45.1 mottakere: hver mottaker krever 20 x 106 donor cellene totalt, 1 del 564Igi og 2 deler PA-GFP. Dermed dette krever 6 x 1/3 x 20 x 106 = 40 x 106 564Igi giver celler og 6 x 2/3 x 20 x 106 = 80 x 106 PA-GFP giver celler. Bland den riktige mengden PA-GFP og 564lgi donor marg i et 50 mL konisk rør. Sentrifuge benmarg blandingen 200 x g og 4 ° C i 10 minutter med en svingende bøtte rotor. Dekanter nedbryting og resuspend cellene i iskalde BM buffer ved en tetthet av 1 x 108 celler per mL. Overføre til en forkjøles 1,5 mL microcentrifuge rør på is. Gjenoppbygge benmarg mottakere med donor benmarg Bedøve mottakere som bruker induksjon med kontinuerlig flyt av 4% isoflurane i luften, etterfulgt av vedlikehold 3,75%. Kontrollere tilstrekkelig flyet av anestesi ved fravær av toe-klype refleks. Sveip forsiktig røret som inneholder benmarg blanding for å sikre tilstrekkelig rørets beinmargen celleområde, så leveringstanken 200 µL av benmarg blanding (~ 20 x 106 celler), i en 0,3 mL, 30 måle insulin sprøyten. Mottakeren på sin side, forsiktig strekke huden over og under øyet til litt “pop øyet ut”, og forsiktig inn i spissen av ca i 30° vinkel foran øyet socket, ta vare for å unngå øyet og de omkringliggende vev. Når spissen av nålen føles å berøre benet understreker øye socket, trekke litt (~0.5 mm) og sakte injisere donor benmargen bruker jevnt trykk.Merk: Det bør være ingen blødninger, ingen lekkasje av væske og ikke veldig liten svulmende av øyet ved injeksjon. Returnere musen til buret med ad lib antibiotika vann og kontroller umiddelbar gjenoppretting fra prosedyren. Gjenta trinn 2.6 for hver mottaker.Merk: Hale blodåre injeksjon kan brukes i stedet for retroorbital injeksjon med samme resultat, men i våre hender det er betydelig langsommere, som kan være en bekymring når du arbeider med store grupper av mottakere. Utvinning av anaesthetized dyr direkte på liten diameter sengetøy bør unngås så det utgjør en aspirasjon og kvelning fare Fjerne antibiotika vann (dag 14) Fjerne antibiotika vannet fra cage(s) og erstatte med fersk vanlige drikkevann. 3. avmerker vellykket rekonstituering og bekrefte passende grad av chimerism (uke 6) Retroorbital blødning av chimeras og kontroller Forberede blod samling rør ved merking 1,5 mL microcentrifuge rør etter mottaker øre-ID-numre og legge til 50 µL av PBS inneholder 5 mM EDTA.Merk: Inkluder aktuelle kontroller for PA-GFP, CD45.1 og CD45.2 og 9 d 11 (idiotype). Dette kan gjøres ved å inkludere 1 PA-GFP + mus, 1 CD45.1 mus, 1 B6 musen og 1 564Igi musen. Bedøve mus og kontroller tilstrekkelig flyet bedøvelse som i trinn 2.6.1. Chimera på sin side, forsiktig strekke huden over og under øyet til litt “pop øyet ut”. Forsiktig inn en BoPET-innpakket heparinized kapillær tube (60 µL interne volum) ca i 40° vinkel foran øyet socket, ta vare for å unngå å skade øyet og de omkringliggende vev. Forsiktig vri/rotere røret til den begynner å fylles med blod. Tillater blodet passivt fylle røret ved kapillær handling, til nesten helt full, deretter trekke røret og plasser den i tilsvarende pre merket samling røret, samtidig som umiddelbart avslappende grep rundt øyet å tillate øyet til utligne tilbake på plass. Blødning bør stoppe umiddelbart. Kontroller at kapillarrør har tømt inn i samling røret og kaste den i en beholder. Lukk røret og invertere tre ganger å sikre fullstendig blande med PBS/EDTA. Hjem musen til buret kontroller umiddelbar gjenoppretting fra prosedyren. Gjenta trinn 3.1 for hver eksperimentelle musen og riktige kontroller.Merk: Ta forsiktig når du bruker submandibular blodåre punktering som denne metoden kan utgjøre en større risiko for adventivskudd infeksjon i bestrålt mottakere før dette er fullt rekonstituert. Videre, i vår erfaring finner vi at volumet av blod samles og mengden blod tapt på grunn av overdreven blødning er mer variabel. Begge disse hensyn er viktig, benmarg chimeras er følsom i rekonstituering fase, før den nye benmargen er fullt engrafted og hematopoiesis har gjenopptatt normalt nivå. Perifert blod mononukleære celle (PBMC) rensing Etter ferdigstillelse av blod samling, kort (10 s) sentrifuge rør ved lav hastighet (< 200 x g) å samle de utvannet stabilisert blod nederst i rørene. Fylle en 10 mL sprøyte med lymfocytt separasjon medium og fest en 18 G pinnen. Sett inn nålen nederst på første røret og underlayer blodprøve med 1 mL av lymfocytt separasjon medium. Nøye trekke nålen og tørk med papirhåndkle å forhindre kryss-kontaminering av neste prøven. Gjennom alle prøvene, og deretter virvel i 25 minutter på 800 x g, i romtemperatur, i en svingende bøtte sentrifuge, med bremsene satt til lav/av. Forberede et sett med tilsvarende merket 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 1 mL av iskalde BM buffer hver. Følgende sentrifugering, for hver prøve, angi øverst (plasma) laget med 200 µL brønnene og Sug opp den mononukleære celle (MNC) lag like over grensesnittet. Overføre cellene til tilsvarende merket røret som inneholder 1 mL av BM buffer. Lukk dekslet og Inverter for å blande. Kast lymfocytt separasjon mediet inneholder røret. Fortsett gjennom alle prøvene og deretter virvel 200 x g i 5 min, 4 ° C i en svingende bøtte rotor. Sug opp forkaste nedbryting og resuspend pellet i 200 µL iskald BM-bufferen. Prøvene er nå klar for antistoff flekker og flyt cytometric analyse. Flekker for flyt cytometric evalueringMerk: Foreslo panelet: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Ikke-aktivert PA-GFP registreres i Pacific oransje (eller tilsvarende) kanalen. Ingen levedyktighet fargestoff er nødvendig som lymfocytt separasjon fjerner døde celler. Bruker brønnene, legge til 100 µL av cellen suspensjon per brønn for hver chimera og kontroll prøve, en 96-brønns plate. For 3 ikke-PA-GFP kontroll eksemplene, basseng de resterende 100 µL av hvert utvalg (300 µL totalt). Legge til 50 µL av dette materialet for unstained kvinne kontroll og enkelt farget kontroll brønner. For PA-GFP single-farget kontrollen i tillegg legge til 50 µL av unstained kvinne PA-GFP prøve. I hver brønn, legge 100 µL av buffer (unstained kvinne), enkelt antistoff (single-farget kompensasjon kontroller, unntatt PA-GFP kompensasjon kontroll) eller antistoff blanding (eksempler). Ruge på isen i 20 minutter. Sentrifuge 200 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Sveiper ut bufferen. Legg til 200 µL BM bufferen i hver brønn og sentrifuge igjen for å vaske. Sveiper ut bufferen og resuspend celler i hver brønn i 200 µL BM bufferen. Prøvene er nå klar for analyse på en flyt cytometer (figur 1).Merk: Germinal sentrum svar i chimeras kan analyseres når som helst fra 6 uker og utover. 4. In vivo merking av marginale sonen/subcapsular sinus å hjelpe identifisering av enkelt germinal sentre Merk: Nåværende protokollen er demonstrert for footpad/hock (femoral lymph node) og intravenøs (IV, milt) injeksjoner, men kan varieres i henhold til målområdet. Bilaterale footpad injeksjon for femoral lymfeknute merking Bedøve musene som i trinn 2.6.1. I en 1,5 mL microcentrifuge tube, fortynne 2 µL av PE-merket rotte anti-musen CD169 antistoff 18 µL av PBS, pH 7.4. Plass to dråper av 10 µL hver av blandingen på et stykke plast parafin film. Sug opp hver dråpe med 0,3 mL insulinsprøyte med en 30 gauge nål. Injisere den 10 µL av merking blanding enten footpad (angi med nålen i 5-10° vinkel i den sentrale delen av footpad, proksimale fra begynnelsen av tærne, og sett inn nålen ca halvveis mot hælen) eller hock (angi med nålen på en 5 – 10 ° vinkel like over hælen og sett om halvveis av sin lengde langs aksen av akillessene i retning mot kneet). Returnere mus til deres burene og vente cirka 15 minutter før du fortsetter med trinn 5. Intravenøs injeksjon for milten merking Bedøve musene som punkt 2.6.1. I en 1,5 mL microcentrifuge tube, fortynne 10 µL av PE-merket rotte anti-musen CD169 antistoff 90 µL av PBS. Sug opp blandingen med en 0,3 mL insulinsprøyte. Utføre retroorbital IV injeksjon som trinn 2.6. Returnere mus til deres burene og vente cirka 15 minutter før du fortsetter med trinn 5.Merk: som et alternativ til isoflurane, injeksjon bedøvende som ketamin/Xylazine blanding kan brukes; men fører dette vanligvis til tregere gjenopprettingstiden. Siden lymfedrenasje påvirkes vanligvis av skjelettlidelser muskel bevegelse, forventes å føre til tregere drenering tid. 5. explanting milten og lymfeknutene og forberede for photoactivation Forberede en tosidig bildebehandling og photoactivation kammer Fjern stempelet fra en 20 mL sprøyte og tilbake belaste den med vakuum fett ved å sette inn munnstykket av en tube med vakuum fett inn i den. Deretter fjerne stempelet fra 5 mL sprøyter og bruk 20 mL sprøyte for å tilbake belaste den med vakuum fett. Bruke vakuum-fett lastet 5 mL sprøyte skal forberede en bildebehandling og photoactivation kammeret ved å plassere en firkantet dekkglassvæske på flatt underlag og spore langs kantene på dekkglassvæske med vakuum fett (ca 1-2 mm i fra kantene).Merk: Pass på å unngå vakuum fett forurensning av alle overflater som senere kommer i kontakt med mikroskopet objektivet, som microdroplets av vakuum fett emulgert i nedsenking vannet kan forurense linsen. Fylle opp dekselet sklisikre vakuum fett kammeret med iskald BM buffer og plasser på en kald flat overflate. Høsting lymfeknuter og milt Euthanize i vivo merket chimeric musen skal analyseres etter trinn 2.2.1. Spray ned carcass med 70% etanol. Du åpner femoral lymfeknute, bruke rett fine saks for å gjøre et snitt i huden like under kneet pit og forlenge kuttet oppover langs hamstring-linjen nesten til hofteleddet. Bruker Dumont #5 eller #7 tang, trekke alle synlige flaps av huden utover, for å avsløre vevet i femoral fossa (figur 2A). Med en Dumont #5 tang, nøye angi femoral fossa bare mediale femoral venen og dissekere åpne fett ved å sette inn og åpne og lukke tang langs aksen av leggen, slik at underliggende femoral lymfeknute. Pop lymfeknute av fossa ved å knipe quadriceps muskel fra forsiden proksimale til kneet med tommelen og pekefingeren (figur 2B). Fange lymfeknute nedenfor med tang å frigjøre den fra de omkringliggende vev (figur 2C) og deretter plassere den i vakuum fett kammeret i trinn 5.1. Gjenta trinn 5.2.2-5.2.4 for kontralateral side. Flere lymfeknuter kan monteres i en enkelt kammer hvis ønskelig. Til slutt Lukk kammeret ved å plassere en andre dekkglassvæske på toppen av vakuum fett felgen og trykke forsiktig ned, ta vare for å extrude alle luftbobler.Merk: Noen av bufferen kan skyves også, men vakuum fett bør danne en tett forsegling, hindrer lekkasje av væske (figur 2D). Lymfeknuter er nå i en tosidig tenkelig kammer. Du åpner milten, med en rett fine saks gjør et snitt gjennom abdominal veggen på venstre side av musen, proksimale til fremre mediale linje, like under brystkasse og utvide den rundt i kroppen til posterior axillaris linjen. Spissen av milten skal vises (figur 3A). Trekk ut milten med et par Dumont #7 tang og kutte av adhesjon på undersiden for å slippe den. Bruk paret rett fine saks for å klippe ~ 2 mm tykk, tverrsnitt, skiver. Sett stykket i vakuum fett kammeret i trinn 5.1. Flere milt skiver kan monteres i en enkelt kammer hvis ønskelig. Til slutt Lukk kammeret ved å plassere en andre dekkglassvæske på toppen av vakuum fett felgen og trykke forsiktig ned, ta vare for å extrude alle luftbobler. Holde alle tenkelig chambers på is til alle tider, bortsett fra under bildebehandling og photoactivation.Merk: Noen av bufferen kan skyves også, men vakuum fett bør danne en tett forsegling, hindrer lekkasje av væske. Milt sektorene er nå i en tosidig tenkelig kammer (figur 3B). 6. Photoactivation Identifisere enkelt germinal sentreMerk: Denne protokollen er beskrevet for milten, men er helt analog for lymfeknutene. Plass tenkelig kammeret på mikroskopet scenen. Bruker en 3,5 mL plast overføring pipette, Plasser en dråpe destillert vann på den øvre dekkglassvæske og lavere målet til kontaktperson. Fokus på vevet med lyset. Bytte til mørk modus og to-fotonet eksitasjon, og Juster at laseren 940 nm.Merk: Med de aktuelle filter settene, denne bølgelengde tillater eksitasjon og oppdagelsen av andre harmoniske generasjon i kollagen-holdig strukturer forbundet med store fartøy og strukturelle elementer, samt CD169-PE injisert i trinn 4.2 som identifiserer marginale sonen. Imidlertid ikke 940 nm eksitasjon ikke photoactivate PA-GFP. Lokalisere personlige hvit-cellulose områder (avgrenset av CD169-PE flekker) nær overflaten av vev, og identifisere periarteriolar lymfoide skjede (PALS, T celle sone) av andre harmoniske generasjon forbundet med den sentrale arteriole. I sonen mellom PALS og marginale sonen, ser for tilstedeværelsen av svært autofluorescent, aktiveres tingible-kropp makrofager (sterk autofluorescent signalet i alle kanaler, blob-lignende utseende med mørk vacuoles) (figur 4A).Merk: Hvis nødvendig på grunn av uønsket retning av vev, tenkelig kammeret kan fleip og bildebehandling kan utføres fra den andre retningen. Basert på kjennetegnene identifisert i trinn 6.1.3., tegne et område rundt identifisere et enkelt germinal sentrum område. Sette opp en Z-stabel med rundt 100-150 µm dybde, starter fra overflaten av vev, og bruker en steg størrelse på ~ 3 µm. Bytt til 830 nm eksitasjon bølgelengde. Slå av eller tone ned alle kanaler for å hindre photodamage detektorer (som laser makt og utgang fluorescens er vanligvis dramatisk høyere på denne bølgelengde), og deretter ‘image’ stabelen.Merk: Bestemte innstillinger, for eksempel laser makt og pixel holdetiden, avhenger av dybden i vevet, bestemt vev brukes og tenkelig systemet. Hvert program må være optimalisert for bestemte tenkelig systemet brukes. Mens det er viktig å få effektiv photoactivation gjennom stabelen, bør utvises ikke å photodamage cellene. Gå tilbake til 940 nm eksitasjon bølgelengde og åpne kanaler. Skanne gjennom stabelen å bekrefte effektiv photoactivation gjennom (figur 4B) og fravær av photodamage (diffus, ikke-celle-avgrenset PA-GFP signal, mørke flekker eller high-graders autofluorescence i photoactivated-området). Videre til photoactivate alle relevante vev i tenkelig kammeret, deretter umiddelbart returnere det til is før videre behandling. Fortsett med photoactivation av flere tenkelig kamre.Merk: Vev explanting, montering og særlig photoactivation er tidkrevende prosesser, men den totale snu-tid skal begrenses til 4-6 timer, å forhindre en dramatisk nedgang i cellen levedyktighet. 7. utvinning og analyse av photoactivated celler Utvinning av lymfocytter fra lymfeknuter og milt For hver photoactivated prøve, forberede en tilsvarende merket 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 500 µL BM bufferen på is. Ta prøver fra en ikke-PA-GFP kontroll og ingen-aktivert PA-GFP mus. Dette kan oppnås ved å inkludere en B6-kontroll og en PA-GFP kontroll mus. Nøye fjerne øvre dekk slip fra tenkelig kammeret, ta vare å opprettholde plasseringen av prøvene (hvis det finnes flere eksempler på en enkelt kammer), og plassere hvert utvalg i sine respektive eksempel rør. Bruker en pistil homogenizer, klem vevet og vri støter i røret å løslate lymfocytter. Bruke brønnene, Sug opp den lysate og filtrere gjennom en 70 µm celle sil i en frisk og pre-avkjølt 1,5 mL microcentrifuge tube. For lymfeknute prøver, hopper du til trinn 7.1.5. For milten prøver, sentrifuge 200 x g i 5 min på 4 ° C i en svingende bøtte rotor. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 200 µL av RBC lyseringsbuffer. Inkuber i 5 min i romtemperatur, og legge til 800 µL iskald BM bufferen og fortsetter å gå 7.1.5. Sentrifuge 200 x g i 5 min på 4 ° C i en svingende bøtte rotor. Forkast nedbryting og resuspend i 200 µL iskald BM-bufferen. Prøvene er nå klar for flekk for flyt cytometric evaluering og sortering, hvis ønskelig. Flekker for flyt cytometric evalueringMerk: Foreslo panelet: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, Fixable levedyktighet fargestoff Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Ikke-aktivert PA-GFP registreres i Pacific oransje (eller tilsvarende) kanalen. Photoactivated PA-GFP registreres i GFP kanalen. Alle co renset makrofager (som kan eller ikke kan ha vært i vivo merket med CD169-PE) kan ekskluderes ved farging med CD169-PE og bruke dette som en dump gate. Bruke brønnene, legge til 100 µL av cellen suspensjon per brønn for hver chimera og kontroll prøve, i en 96-brønns plate. For B6 kontroll eksemplene, legge 50 µL av dette materialet for unstained kvinne kontroll og enkelt farget kontroll brønner. For ingen-aktivert PA-GFP single-farget kontrollen i tillegg legge til 50 µL av unstained kvinne ingen-aktivert PA-GFP prøve. Basseng det gjenværende materialet for alle photoactivated utvalg for aktivert PA-GFP single-farget kontrollen. Hver Vel, legge 100 µL av buffer (unstained kvinne og PA-GFP kompensasjon kontrollerer), enkelt antistoff (single-farget kompensasjon kontroller) eller antistoff blanding (photoactivated eksempler). Ruge på isen i 20 minutter. Sentrifuge 200 x g 5 minutter på 4 ° C. Sveiper ut bufferen. Legg til 200 µL BM bufferen i hver brønn og sentrifuge igjen for å vaske. Sveiper ut bufferen og resuspend celler i hver brønn i 200 µL BM bufferen. Prøvene er nå klar for analyse på en flyt cytometer eller sorter (representant resultater i figur 5).

Representative Results

Generasjon av blandet benmarg chimeras Nåværende protokollen oppnår robust blandet benmarg chimeras med et nesten fullstendig chimerism i B-celle rommet som vist i representant resultatet i figur 1 (for statistisk betydning se 12). Serotyping avslører normalisert B-cellen tallene på 6 uker innlegg rekonstituering (figur 1A), med en lav frekvens 9 d 11 (idiotype) positive sirkulerende B celler avledet fra det 564Igi rommet (figur 1B). I den totale lymfocytt gate, det er en lav frekvens av gjenværende mottaker-avledet celler, ~ 6% CD45.1 (Q1), som angir en generell grad av chimerism ~ 94% (figur 1 c). I donor kupé (CD45.1-, Q4 + Q3) forholdet mellom 564Igi (Q4) til PA-GFP (Q3) er rundt 23 til 77%. Dette avledet litt lavere enn input 33 til 66% forholdet er forklart av tunge negative valg av B-celler fra den 564Igi kupeen 12. Som vist i figur 1 d, det er nesten fullstendig chimerism i B-celle batterirommet (99,9% CD45.1-) og dominans av PA-GFP Ben margtransplantasjon-avledet B celler (Q3), som er en konsekvens av tunge negative valg av 564Igi-avledet B celler. Av vev, behandling og flyt cytometric evaluering Figur 2 og Figur 3 viser prosedyrer for og resultatene av explanting fersk isolert lymfeknuter og milt skiver. Figur 4 presenterer et representativt resultat for i vivo merking og photoactivation av en enkelt germinal sentrum i en explanted milt skive. Som kan ses (figur 4A), i vivo merkingen med CD169-PE har robust merket marginale sonen (rød, angitt med “MZ”). Andre harmoniske signalet er synlig i kollagen-holdig strukturelle elementer og store fartøy (blå), inkludert det sentrale arteriole av periarteriolar lymfoide skjede (venner). Svært autofluorescent, aktiveres tingible-kropp makrofager er forbundet med germinal sentrum aktivitet (pilspisser). Samlet lar identifikasjon av marginale sonen, venner og tingible kroppen makrofager, identifikasjon av et område av interesse som trolig inneholder en enkelt germinal sentrum. Området rundt er photoactivated som vist i figur 4B. Som vist, er photoactivation microanatomically nøyaktig9, gir et definert område av aktivisering. Presentert resultatene i tillegg tjene som bekreftelse på en høy tetthet av PA-GFP + lymfocytter i rekonstituert chimeras og tilstedeværelsen av spontane germinal sentre. Nedstrøms flyt cytometric evaluering videre bekrefter normalisert B celle kupé tall (figur 5 d), en spontan germinal sentrum befolkning (figur 5E) og tilstedeværelsen av en gruppe germinal sentrum B celler som har vært photoactivated (figur 5F). Dermed gir presentere protokollen en robust metode for generering av blandet benmarg chimeras spontan autoreactive germinal sentre, som hovedsakelig består av vill-type avledet B-celler som bærer en photoactivatable reporter. Dette gir i sin tur nedstrøms analyser av personlige germinal sentre (grafisk oversikt i figur 6). Figur 1: Flow cytometric vurdering av graden av chimerism i blodet av 564Igi (CD45.1-, PA – GFP-): PA-GFP (CD45.1, PA-GFP +) blandet chimeras i drepende bestrålt CD45.1 mottakere (CD45.1 +, PA – GFP-), 6 uker post rekonstituering. A) Plot viser gating B220 + B celler, pre gated på singlet lymfocytter. B) Subgate fra tomten A, viser 9 d 11 + (idiotype) frekvensen i B-celle befolkningen. C) Plot av PA-GFP mot CD45.1, pre gated på singlet lymfocytter. D) Plot av PA-GFP mot CD45.1 i B-celle subgate fra tomten A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: Prosedyre for høsting og montering femoral lymfeknuter for bildebehandling og photoactivation. A) et snitt er gjort under kneet og utvidet til hofteleddet og kantene er trukket til sidene, slik at femoral fossa (pilspiss). B) den overliggende fatpad er åpnet og femoral lymfeknute er eksponert (pilspiss). C) femoral lymfeknute hentes fra fossa. D) fremgangsmåten gjentas for kontralateral siden og begge nodene er montert i et tosidig dekkglassvæske/vakuum-fett kammer fylt med BM buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: prosedyre for høsting og montering milten for bildebehandling og photoactivation. En) et snitt er gjort på fremre mediale linjen rett under brystkasse og utvidet rundt kroppen til posterior axillaris linjen, og kantene er trukket for å avsløre spissen av milten (pilspiss). B) milten er trukket forbrukeravgift og skåret i tynne (1-2 mm) skiver, som er montert i et tosidig dekkglassvæske/vakuum-fett kammer fylt med BM buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: Photoactivation. A) to-fotonet mikroskop-bilde av en germinal sentrum i milten før photoactivation. In vivo merking med anti-CD169-PE ble utført før innhøsting av milten merke marginale sonen (rød, angitt med “MZ”). Den andre harmoniske signal er tydelig i kollagen-holdig strukturer knyttet til integument og store fartøy (blå). Pilspisser identifisere svært autofluorescent, aktiveres tingible-kropp makrofager knyttet germinal sentrum aktiviteten. Bildebehandling ble utført på 940 nm eksitasjon. Baren skala i hjørnet øverst til venstre angir 200 µm. B) som A, men etter photoactivation på 830 nm. Photoactivated celler er nå synlig (grønn) i et definert område av interesse avgrenset av marginale sonen og omfatter de tidligere identifisert tingible kroppen makrofagene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5: Flow cytometric analyse av photoactivated germinal sentrum B celler. A) Plot forover mot siden scatter og lymfocytt porten. B) Plot frem scatter området som en funksjon av fremover scatter høyde i lymfocytt gate og resulterende singlet gate. C) levedyktighet fargestoff utelukkelse tomten i singlet gate og resulterende levende celle gate. D) Gating B220 + B celler. E) Gating germinal sentrum B celler, identifisert som CD38lo GL7hi celler i B220 + porten. F) Gating av photoactivated celler i GC B celle befolkningen, identifisert som delsettet med celler uttrykke co ingen-aktivert og photoactivated PA-GFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 6: grafoversikt over protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Et stort antall murine modeller av autoimmunitet er tilgjengelig, hvorav mange gi spontan germinal sentre¹⁶. Men havn mange av de tilgjengelige modellene komplekse genetiske bakgrunner eller mutasjoner i sentrale regulatorer av lymfocytt spredning eller aktivisering, gjør dem dårlig egnet til intercrossing med reporter og studier av normal lymfocytt atferd i autoimmunitet, henholdsvis. Den nåværende modellen, tvert imot, kan en “plug-and-play”-tilnærming til Dyptgående analyser av autoreactive vill-type-avledet germinal sentrum B celler ved hjelp av en ønsket kombinasjon av effekter av transgener, knock-outs og journalister, i den foreliggende sak representert ved photoactivatable GFP. Bruker i vivo merking strategier, kan enkelt germinal sentre visualiseres i explanted lymfoid vev og deres mobilnettet bestanddeler photoactivated bruker en to-fotonet mikroskop. Photoactivated lymfocytter fra enkelt germinal sentre kan deretter analysert eller sortert flyt cytometrically, som enkeltceller eller samtidig. Disse cellene kan deretter bli utsatt for flere nedstrøms molekylære og funksjonelle analyser å gi fornyet innsikt i feltet av autoimmunitet.

Det er noen viktige trinn for vellykket forestilling av denne prosedyren. Som demonstrert av representant resultatene, irradiation (1100 Rad) og donor benmarg rekonstituering kunne erstatte mottaker benmarg batterirommet gir nesten fullstendig chimerism i B-celle rommet. Dette er et viktig poeng, som gjenværende mottaker-avledet B celler ville gjøre et delsett av befolkningen germinal sentrum “mørke”. Uavhengig av kilden brukes for bestråling, må dose/tidspunktet for bestråling være optimalisert for å gi maksimal myeloablative effekt med minimal sivile vevsskade dyrene. Til rekonstituering, har bone-knuse protokollen og rekonstituering med 20 millioner totalt donor cellene blitt funnet for å gi robust høy rekonstituering grader. Arbeider sterile og kalde/på is benmarg utvinning sikrer høy levedyktigheten til donor benmarg. For å nå ønsket donor benmarg forholdstall, er det viktig å utøve stor forsiktighet ved telling dele cellene, både for telling selve og når du tar ut subsample i benmargen for opptelling. Miksing og co pelleting donor-marrows, i stedet for sentrifugering og resuspending separat og deretter miksing, tjener til å forhindre noen skew i donor prosenter etter celle telling.

Blandet benmarg chimera generering av protokollen kan stå alene, og du kan generasjon av chimeras med autoreactive germinal sentre med ønsket reporter, transgene eller bank-out. Imidlertid er en begrensning på dette behovet for å bruke histocompatible givere. 564Igi belastningen er på C57Bl/6J congenic bakgrunn, og som en konsekvens, den andre donor(s) og mottakerne bør ha en H-2b congenic bakgrunn (eller eventuelt 564Igi belastningen bør være backcrossed til ønsket belastning og autoimmune fenotypen bekreftet på ny bakgrunn). Bestråling prosedyren tendens til å favorisere en tolerogenic miljø¹⁷, og uoverensstemmelser i noen mindre histocompatibility antigener kan tolereres. Men bør dette aspektet nøye vurderes, spesielt hvis blande mannlige og kvinnelige givere og/eller mottakere, på grunn av potensialet for kvinnelige kryssreaksjon med mann-begrenset Y-antigener.

Tilsvarende det photoactivation aspektet av protokollen kan stå alene, og kan brukes i mange forskjellige sammenhenger. Imidlertid er PA-GFP reporteren bare tilgjengelig med den UBC utbyggeren, som er aktive i alle blodkreft avstamning celler, men ikke i stromal celler. Som nevnt i innledningen, andre photoactivatable, photoswitchable eller photoconvertible reporter stammer er tilgjengelig, og kan erstatte PA-GFP, med riktig justering av eksperimentelle forhold.

Det er viktig å unngå utilsiktet photoactivation av uønskede områder, ved å opprettholde laser godt over 900 nm når imaging, da dette bølgelengde vil ikke photoactivate PA-GFP. For photoactivation selv, bestemte innstillinger, for eksempel laser makt og pixel holdetiden, vil avhenge av dybden i vevet, bestemt vev brukes og tenkelig systemet, og hvert program har å optimaliseres for bestemte tenkelig systemet brukes. Forsiktighet bør utvises ikke å photodamage cellene, men det er samtidig viktig å få effektiv photoactivation gjennom bunken, for å få en tilstrekkelig representasjon av aktivert celler for nedstrøms analyser. Germinal sentrum B celler generelt utgjør overalt fra 0,5% til ~ 2% av splenic eller kutan lymfeknute B celler, og som kan sees fra representant resultatene (figur 5), photoactivated eneste germinal sentrum B celler kan gjøre opp ~ 1% av totalen befolkningen i en enkelt milt skive. Derfor krever vellykket analyse eller sortering av et betydelig antall celler behandling av en rekke hendelser.

Materials

Antibody, 9D11-A568	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647	In-house generated		9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker)	Biolegend	144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1)	Biolegend	142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38	Biolegend	102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220	Biolegend	103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized	Fisher Scientific	211766
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Conical tubes, 50 mL	Falcon	352235
Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm	Thermo Fisher Scientific	22X22-1
EDTA	Merck	1,084,180,250
Ethanol, 70%	VWR	8301.360
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270106
Flow cytometer, FACS Canto II	BD Biosciences	338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP	BD Biosciences	–	Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning	VWR	DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk	VWR	630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet.	Orion Pharma	9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media)	Cedarlane	CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf)	Sarstedt	72.690.550
Microscope, Two-photon	Prairie Technologies (now Bruker)	–	Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml	VWR	410-0110
NaHCO3	Merck	1063290500
Needle, 18 gauge	BD Medical	304622
NH4Cl	VWR	87,769,290
PBS	Sigma	d8537
Pestle homogenizer	VWR	47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm	VWR	410-0122
Pipette, Serological, 10 ml	VWR	612-3700
Pipette, transfer, plastic	Sarstedt	861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M)	Bemis	PM996
Plate, 96-well	Falcon	353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps	FST – Fine Science Tools	91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps	FST – Fine Science Tools	91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight	FST – Fine Science Tools	91460-11
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ES1
Syringe, 20 mL	Terumo	SS-20ES1
Syringe, 5 mL	Terumo	SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc	BD Medical	324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml	MSD Animal health	431577
Trypan blue solution, 0.4%	VWR	K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	65-0865-14