용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징
Summary
용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.
Abstract
면역 표지에 의한 조직 및 기관의 감염 과정의 시각화는 현대 감염 생물학의 핵심 방법입니다. 장기 조직의 내부 병원체의 분포, 트로피즘 및 풍부를 관찰하고 연구하는 능력은 질병 발달과 진행에 대한 중추적 인 데이터를 제공합니다. 기존의 현미경 검사법을 사용하여, 면역 표지는 주로 파라핀 임베디드 또는 냉동 샘플에서 얻은 얇은 단면으로 제한됩니다. 그러나, 이 얇은 단면도의 한정된 2D 심상 평면은 감염한 기관의 복잡한 구조 및 감염의 세포 문맥에 중요한 정보의 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 현대다색, 면역염색 호환 조직 청산 기술은 이제 바이러스에 감염된 장기 조직의 대용량 3D 이미지 스택을 연구하는 비교적 빠르고 저렴한 방법을 제공합니다. 유기 용매에 조직을 노출시킴으로써 광학적으로 투명해집니다. 이는 샘플의 굴절 지수와 일치하며 결국 광 산란이 크게 감소합니다. 따라서, 긴 자유 작동 거리 목표와 함께, 최대 1mm 크기의 큰 조직 섹션은 고해상도에서 기존의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법(CLSM)에 의해 이미지화될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 바이러스 병인, 퍼짐, 트로피즘 및 신경 침략 같이 주제를 공부하기 위하여 감염된 두뇌에 있는 광견병 바이러스 분포를 구상하기 위하여 조직 정리 후에 심층 조직 화상 진찰을 적용하는 프로토콜을 기술합니다.
Introduction
전통적인 조직학 기술은 주로 복잡한 3D 환경에 대한 2D 통찰력만 제공할 수 있는 장기 조직의 얇은 부분에 의존합니다. 원칙적으로 가능하지만, 직렬 얇은 섹션에서 3D 재구성은 획득 한 이미지의 실리코 정렬에슬라이스 및 후속 모두 까다로운 기술 파이프 라인을 필요로1 . 또한, 마이크로토임 슬라이싱 후 z-volumes의 원활한 재구성은 비오버랩 이미지 평면, 염색 변형 및 물리적으로 인한 최적이 아닌 이미지 등록으로 인해 기계적 및 계산 적 아티팩트가 모두 남아 있기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 마이크로토메 블레이드에 의해 조직의 파괴. 대조적으로, 그대로 두꺼운 조직 샘플의 순수한 광학 슬라이스는 중첩 이미지 평면 (오버 샘플링)의 수집을 허용하고, 따라서, 3D 재구성을 용이하게한다. 이것은, 차례로, 복잡한 세포 집단에 있는 감염 프로세스의 분석을 위해 높게 유리합니다 (예를 들면, 주변 신경교 및 면역 세포의 맥락에서 신경 세포). 그러나, 두꺼운 조직 단면도의 내재된 장애물은 조직으로 광 산란 및 제한된 항체 침투를 포함합니다. 최근에는이러한문제를 극복하기 위해 다양한 기술이 개발되고 최적화되어 2, 3,4,5,6,7,8 , 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13. 본질적으로 대상 조직은수성2,3,4,5,6및7로 처리하여 광학적으로 투명하게 바뀌습니다. ,8,9 또는 유기 용매 기반10,11,12,13 솔루션. 3DISCO (용매 클리어 기관의 3D 이미징)11,12 및 그 후속 uDISCO (용매 클리어 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징)13의 도입은 상대적으로 빠르고 간단하고 저렴한 도구를 제공 우수한 클리어링 기능. 클리어링 프로토콜의 주요 성분은 유기 용매 테르트-부탄올(TBA), 벤질 알코올(BA), 벤질 벤조에이트(BB), 및 디페닐 에테르(DPE)이다. iDISCO(용매 클리어란의 면역표지 지원 3D 이미징)의 개발 및 추가14,호환 가능한 면역 염색 프로토콜은 기존 방법에 비해 또 다른 장점을 구성하고 항원의 심부 조직 라벨링을 가능하게 하였다. 면역 염색 된 샘플의 장기 저장뿐만 아니라 관심의. 따라서, iDISCO14 와 uDISCO13의 조합은 기존의 CLSM을 사용하여 큰 조직 섹션 (최대 1mm)에서 항체 표지 단백질의 고해상도 이미징을 허용합니다.
모든 3 차원에서 장기의 복잡 한 구조의 보존은 뇌 조직에 대 한 특히 중요 하다. 뉴런은 그들의 신경질적 투영에 기초하여 매우 다양한 3D 형태학을 가진 매우 이질적인 세포 하위 집단을 포함한다 (Masland15에의해 검토됨). 더욱이, 뇌는 신경교 세포 및 뉴런을 포함하는 상이한 세포 소집단 및 비율로 각각 구성된 다수의 구획 및 하위구획으로 구성된다(폰 바르톨드 등 16). 신경 트로픽 바이러스로서, 광견병 바이러스 (RABV, Fookset al. 17)는 주로 뉴런을 감염시키고, 그들의 수송 기계를 사용하여 감염의 기본 부위에서 중추 신경계 (CNS)로 의 축삭을 따라 역행 방향으로 여행합니다. 여기서 설명된 프로토콜(도1A)은 감염된 뇌 조직으로부터 수득된 크고 일관된 이미지 스택에서 RABV 및 RABV 감염 세포의 면역 염색 보조 검출 및 시각화를 허용한다. 이를 통해 감염 환경에 대한 편견없는 3D 고해상도 평가를 가능하게 합니다. 다양한 종으로부터의 뇌 조직에 적용 가능하며, 고정 직후 또는 파라포름알데히드(PFA)에서 시료를 장기간 보관한 후 즉시 수행할 수 있으며, 수개월 동안 염색 및 시료의 저장 및 재이미징을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근 몇 년 동안 조직 정리 기술의부활과 추가 개발 2, 3,4,5,6,7,8, 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13세</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 토마스 C. 메텐라이터와 베레나 테 캄프가 원고를 비판적으로 읽어 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 메클렌부르크 서부 포메라니아의 연방 우수 이니셔티브와 유럽 사회 기금 (ESF) 그랜트 KoInfekt (ESF/ 14-BM-A55-0002/16)와 에서 Lyssaviruses에 대한 교내 공동 연구 보조금에 의해 지원되었다 프리드리히 로플러 연구소 (리-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
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