Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe
Summary
Neuartige, immunstaining-kompatible Gewebeclearing-Techniken wie die ultimative 3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen ermöglichen die 3D-Visualisierung von Tollwutvirus-Hirninfektionen und ihrer komplexen zellulären Umgebung. Dicke, antikörperbeschriftete Hirngewebescheiben werden optisch transparent gemacht, um die Bildtiefe zu erhöhen und eine 3D-Analyse durch konfokale Laserscanmikroskopie zu ermöglichen.
Abstract
Die Visualisierung von Infektionsprozessen in Geweben und Organen durch Immunlabeling ist eine Schlüsselmethode in der modernen Infektionsbiologie. Die Fähigkeit, die Verteilung, den Tropismus und die Häufigkeit von Krankheitserregern innerhalb des Organgewebes zu beobachten und zu untersuchen, liefert entscheidende Daten über die Entwicklung und das Fortschreiten von Krankheiten. Mit herkömmlichen Mikroskopieverfahren ist die Immunkennzeichnung meist auf dünne Abschnitte beschränkt, die aus paraffineingebetteten oder gefrorenen Proben gewonnen werden. Die begrenzte 2D-Bildebene dieser dünnen Abschnitte kann jedoch zum Verlust wichtiger Informationen über die komplexe Struktur eines infizierten Organs und den zellulären Kontext der Infektion führen. Moderne mehrfarbige, immunstaining-kompatible Gewebeclearing-Techniken bieten jetzt eine relativ schnelle und kostengünstige Möglichkeit, hochvolumige 3D-Bildstapel von vireninfiziertem Organgewebe zu untersuchen. Durch die Exposition des Gewebes gegenüber organischen Lösungsmitteln wird es optisch transparent. Dies entspricht den Brechungsindizes der Stichprobe und führt schließlich zu einer signifikanten Reduzierung der Lichtstreuung. So können in Kombination mit langen freien Arbeitswegobjektiven große Gewebeabschnitte bis zu einer Größe von 1 mm durch die konventionelle konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) mit hoher Auflösung abgebildet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Anwendung von Tiefengewebe-Bildgebung nach Gewebeklärung, um die Verteilung von Tollwutviren in infizierten Gehirnen zu visualisieren, um Themen wie Viruspathogenese, Ausbreitung, Tropismus und Neuroinvasion zu untersuchen.
Introduction
Herkömmliche Histologietechniken basieren meist auf dünnen Abschnitten von Organgeweben, die von Natur aus nur 2D-Einblicke in eine komplexe 3D-Umgebung liefern können. Obwohl grundsätzlich machbar, erfordert die 3D-Rekonstruktion aus seriellen dünner Abschnitte anspruchsvolle technische Rohrleitungen sowohl für das Schneiden als auch für die anschließende Silico-Ausrichtung der aufgenommenen Bilder1. Darüber hinaus ist eine nahtlose Rekonstruktion von Z-Volumes nach dem Mikrotom-Schneiden von entscheidender Bedeutung, da sowohl mechanische als auch rechnerische Artefakte aufgrund einer suboptimalen Bildregistrierung bleiben können, die durch nicht überlappende Bildebenen, Färbungsvariationen und physikalische Zerstörung von Gewebe z.B. durch die Mikrotomklinge. Im Gegensatz dazu ermöglicht das reine optische Schneiden intakter dicker Gewebeproben die Erfassung überlappender Bildebenen (Oversampling) und erleichtert damit die 3D-Rekonstruktion. Dies wiederum ist sehr vorteilhaft für die Analyse von Infektionsprozessen in komplexen Zellpopulationen (z.B. neuronale Netzwerke im Kontext der umgebenden Glia- und Immunzellen). Zu den inhärenten Hindernissen dicker Gewebeabschnitte gehören jedoch Lichtstreuung und ein begrenztes Eindringen von Antikörpern in das Gewebe. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt und optimiert, um diese Probleme zu überwinden2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Im Wesentlichen werden Zielgewebe durch Behandlung mit wässrigen2,3,4,5,6,7 optisch transparent gedreht ,8,9 oder organische lösemittelbasierte10,11,12,13 Lösungen. Die Einführung von 3DISCO (3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen)11,12 und seinem Nachfolger uDISCO (ultimative 3D-Bildgebung von lösungsmittelgereinigten Organen)13 bot ein relativ schnelles, einfaches und kostengünstiges Werkzeug mit hervorragende Clearing-Fähigkeiten. Die Hauptbestandteile des Clearingprotokolls sind die organischen Lösungsmittel tert-Butanol (TBA), Benzylalkohol (BA), Benzylbenzoat (BB) und Diphenylether (DPE). Die Entwicklung und Zugabe von iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)14, ein kompatibles Immunstaining-Protokoll, stellte einen weiteren Vorteil gegenüber bestehenden Methoden dar und ermöglichte die Tiefengewebekennzeichnung von Antigenen sowie die langfristige Lagerung von immunbefleckten Proben. So ermöglicht die Kombination von iDISCO14 und uDISCO13 die hochauflösende Bildgebung von antikörperbeschriftten Proteinen in großen Gewebeabschnitten (bis zu 1 mm) mit herkömmlichem CLSM.
Die Erhaltung der komplexen Struktur eines Organs in allen drei Dimensionen ist besonders wichtig für das Hirngewebe. Neuronen bestehen aus einer sehr heterogenen zellulären Subpopulation mit sehr unterschiedlichen 3D-Morphologien, die auf ihren Neuritenprojektionen basieren (rezensiert von Masland15). Darüber hinaus besteht das Gehirn aus einer Reihe von Kompartimenten und Unterabteilungen, die jeweils aus verschiedenen zellulären Subpopulationen und Verhältnissen davon bestehen, einschließlich Gliazellen und Neuronen (überprüft von Bartheld et al.16). Als neurotropes Virus infiziert das Tollwutvirus (RABV, überprüft von Fooks et al.17) in erster Linie Neuronen, indem es ihre Transportmaschinen nutzt, um in retrograde Richtung entlang von Axonen vom primären Infektionsort zum zentralnervösen System (ZNS) zu reisen. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1A) ermöglicht die immunstainierungsunterstützte Detektion und Visualisierung von RABV- und RABV-infizierten Zellen in großen, kohärenten Bildstapeln aus infiziertem Hirngewebe. Dies ermöglicht eine unvoreingenommene, hochauflösende 3D-Bewertung der Infektionsumgebung. Es gilt für Hirngewebe aus einer Vielzahl von Arten, kann unmittelbar nach der Fixierung oder nach der Langzeitlagerung von Proben in Paraformaldehyd (PFA) durchgeführt werden und ermöglicht die Lagerung und Reimaging von gefärbten und gereinigten Proben für Monate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Wiederaufleben und die Weiterentwicklung von Gewebeclearing-Techniken in den letzten Jahren2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Thomas C. Mettenleiter und Verena te Kamp für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Bundesexzellenzinitiative Mecklenburg-Vorpommern und den Europäischen Sozialfonds (ESF) Zuschuss KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) und ein intramurales Gemeinschaftsforschungsstipendium zu Lyssaviren an der Friedrich-Loeffler-Institut (Ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
