Här presenteras ett protokoll över ex vivo maternell vaskulär per fusion för att möjliggöra administrering av en test artikel till maternell kärl och för att utvärdera överföring av xenobiotiska partiklar eller farmakologiska agens i placenta, utöver förändringar i placenta fysiologi.
Moderkakan är ett viktigt organ under graviditeten som fungerar som ett hinder för fetal xenobiotiska exponering och förmedlar utbyte av näringsämnen för avfall. Ett test beskrivs här för att parfymera en isolerad råtta moderkakan och utvärdera moderns till foster flyttning av xenobiotika ex vivo. Dessutom kan utvärderingen av fysiologiska processer såsom vätske flöde till fostret och placenta metabolism genomföras med denna metod. Denna teknik är lämplig för att utvärdera maternell kinetik av farmaceutiska kandidater eller miljö föroreningar. I motsats till nuvarande alternativa metoder, denna metod gör det möjligt att utvärdera den isolerade moderns-fetal vaskulatur, med systemisk neurala eller immun engagemang bort, så att alla observerade förändringar i fysiologiska funktionen att vara som kan hänföras till lokala faktorer inom den isolerade vävnaden.
Genom att bibehålla morfologisk struktur och fysiologisk reaktionsförmåga har orgel per fusion varit en accepterad system-eller vävnadsbaserad metod för att analysera metabolisk funktion. Dessa per fusions teknik möjliggör ex vivo-undersökning av intakta vävnads reaktioner på en mängd olika farmakologiska och mekaniska stimuli. Per fusion av mänsklig moderkakan beskrevs initialt i 1958 för att identifiera de hormonella effekterna på den metaboliska aktiviteten av citron syra cykeln; efter att tidigare ha identifierats i vävnad homogenater, Troen och Gordon erkänt behovet av att klargöra endokrina aktiviteten med hjälp av en ny fysiologisk metod1. I samma epok, Single-perfusion (maternell-till-fetal eller fetal-till-maternell) strategier beskrevs i stora2,3 och små4 djur modeller för att förstå placenta överföring av socker, salter, och antipyrin droger. Tekniker för in vivo och ex vivo Dual-perfusion (samordnad maternell och fetal per fusion) beskrevs för att ytterligare karakterisera placentaöverföring med metoder för in vivo5 och ex vivo6,7,8 . Tekniska framsteg inom transmission och scanning elektronmikroskopi tillät forskarna att kontrol lera den strukturella och funktionella integriteten hos mänskliga placenta vävnader efter per fusion9.
Medan per fusion av mänskliga placenta vävnader och enskilda Auktor är mest relevant, den snabba utvecklingen av farmakologiska agens och miljömässiga föroreningar nödvändiggör användning av en djur per fusion modell för tidig screening av xenobiotiska överföring över placentabarriären. Denna placenta per fusion metod möjliggör utvärdering av överföring över placentabarriären med hjälp av lättare uppnåeliga och fysiologiskt relevanta råtta placenta. Dessutom kan vätske flödet över placentabarriären under en tids period efter en exponering utvärderas genom att mäta volymen av parfymsat som kommer från navel strängen. I kraft av att tillåta placenta per fusion från både moderns och fostrets cirkulationer, denna Dual-Flow hela organ strategi kan vara fördelaktigt jämfört med nuvarande in vitro-och in vivo-metoder. Denna metod gör det möjligt för administrationen av en xenobiotiska genom moderns aspekt mätas från parfymsat som framträder över moderkakan genom navel venen, eller vice versa. Det protokoll som presenteras här kommer att beskriva överföringen av 20 nm polystyren (en gemensam nanoplast som används i livsmedel och medicintekniska produkter) från moderns livmoder artär till foster facket och en associerad minskning av vätske flödet över moderkakan att illustrera användning av denna metod i flera fysiologiska, farmakologiska och toxikologiska inställningar för att bedöma överföring av placenta, metabolism och fysiologiska förändringar som påverkar moderns och/eller fostrets flöde.
Denna per fusions metod möjliggör snabb bedömning av placentabarriären och fysiologisk funktion hos livmoder-och trofoblastskiktet. Kanylering och per fusion av den proximala till distala ändarna av moderns uterin artär simulerar fysiologi maternell blod flöde genom detta stora fartyg som ansvarar för att skicka blod till det utvecklande fostret. Denna metod möjliggör fysiologisk utvärdering av isolerade maternell, placenta och navel Strängs kärl, och därför kan förändringar i fysiologi identifieras som vaskulär patologi; immun försvaret och neurala innervationer avlägsnas i ex-vivo-proceduren. För att säkerställa korrekt utvärdering, är det därför viktigt att kanylera dessa fartyg noggrant för att inte skapa några tårar eller punkteringar i kärl väggarna, och att ta bort luft bubblor. Gas embolier kan orsaka skador på endoteliala lagret av kärl eller hindra blod kärlen. Genom att bibehålla den vaskulära kopplingar mellan livmodern, moderkakan och foster under dissektion, utvärdering av vätska och translokation till fostret kan observeras. Med administrationen av en xenobiotic, i detta fall 20 nm polystyren, kinetik till den distala änden av livmoder artären och genom moderkakan till foster facket kan utvärderas genom analys av spill vatten under en tid under 180 minuter.
Medan en dual-perfusion modell beskrevs och överföring av partiklar och vätska från moderns till foster facket övervakades i denna artikel, kan utvärderingar också göras i omvänd från foster till moderns facket. En begränsning av den metod som beskrivs här är att den distala uterin venen inte kanyleras eller provtagning. I framtida studier, särskilt de som fokuserar på foster-till-maternell överföring, det kommer att vara viktigt att kanylera och prov den distala uterin kärlet. De utsläpp som tas från denna mock experiment användes för att bedöma xenobiotiska överföring; emellertid, ett brett spektrum av bedömningar som rör endokrina och molekyl ära placenta funktioner eller Foster näring kan utföras.
Styrkan i detta protokoll uppväger vida dess mindre begränsningar. Preparatet upprätthåller den fysiologiska strukturen och integriteten hos ett helt organ för att bedöma experimentella förhållanden. Ex vivo placenta per fusion är en vetenskaplig progression från cellulär-baserade in vitro till hela djur exponering för att korrekt fastställa reproduktiv riskbedömning. Detta kan anses vara en värdefull teknik för studier som utvärderar placenta farmakologisk läkemedelsdisposition, farmakokinetik, toxikologi, fysiologi, och maternell-fetal medicin.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det nationella institutet för miljö hälso vetenskaper (R00-ES024783), Rutgers centrum för miljö exponeringar och sjukdomar (P30-ES005022), och Rutgers gemensamma Graduate program i toxikologi (T32-ES007148). Vi vill också tacka DRS. Michael Goedken, Marianne Polunas, och Pedro Louro för deras tekniska expertis och Dr. Adam goodwill för hans hjälp med att designa vår per fusion Schematisk (figur 5).
Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile | Surgical Specialties Look | AACO805 | |
Fine forceps | FST by Dumont Switzerland | 11252-20 | |
Fine scissors | FST by Dumont Switzerland | 14060-10 | |
Glass cannula pack | Living Systems Instrumentation (LSI) | GCP-75-100 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED | Fisherbrand | 02-681-299 | |
Non-serrated fine curved micro serrefine clamps | InterFocus | 18052-03 | |
Perfusate pump | ISMATEC | ISM795C | |
Pressure monitor | Living Systems Instrumentation (LSI) | Mode PM-4 | |
Self-heating single vessel chamber | Living Systems Instrumentation (LSI) | CH-1 | |
Servo Pump | Living Systems Instrumentation (LSI) | ModelPS-200-P | |
Stainless steel blunt needle 23 gauge | Component Supply Co. | 04651-01 | |
Stainless steel blunt needle 25 gauge | Component Supply Co. | 07116-01 | |
STERILE Nylon Suture | AROSurgical Instruments Corporation | T04A00N07-13 | |
Stopcock | Sedation Resource | 6-205-04 | |
Temperature Controller | Living Systems Instrumentation (LSI) | Model TC-09S |